从大米蛋白胰蛋白酶酶解物中分离纯化免疫活性肽

来源 :长沙理工大学 | 被引量 : 7次 | 上传用户:lqy760305
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2014年中国稻谷总产量为2亿t左右,居世界前列。在稻米各加工领域,每年产生了大量的碎米、米糠和米渣等副产物,特别是发酵及淀粉工业产生的副产物米渣,其蛋白含量高达40%60%。但这些副产物大部分被直接当做饲料,并没有充分地开发利用。大米蛋白氨基酸组成配比接近WHO/FAO推荐的理想模式,较大豆分离蛋白及乳酪蛋白更优,可与牛乳、鸡蛋、牛肉相媲美;并且大米蛋白属于低抗原性蛋白,不会引起过敏反应,很适合作为生产婴幼儿食品的原料。同时,老龄化、肥胖症、睡眠时间或质量下降、吸烟与饮酒等不良生活习惯皆可能导致机体免疫力下降而引发各种疾病。因此,寻求适宜的免疫调节剂来提高人体免疫能力,也成为了当今社会的需求热点。利用米渣、碎米等大米加工副产物为原料,通过酶法制备大米免疫活性肽,不仅可为免疫力低下的人群和婴幼儿提供低过敏性的免疫调节剂,同时还可有效提高大米加工副产物的附加值,具有重要的社会效益和较高的经济效益。论文根据蛋白酶的酶切位点选择了9种待筛酶种对大米蛋白进行酶解,综合考虑酶解产物的小鼠巨噬细胞增值指数SI、得率及分子量分布筛选出的最佳酶种为胰蛋白酶,其酶解产物对小鼠巨噬细胞增值指数SI、分子量小于1 000组分所占比例及活性肽得率分别为1.597(1 000 g/mL)、74.11%和75.96%。在酶种确定后以小鼠巨噬细胞SI值为考察指标,考察了温度、时间、pH、底物浓度及加酶量对大米蛋白酶解物(Rice protein hydrolysates,RPHs)SI值的影响,通过单因素试验和响应面试验优化的胰蛋白酶酶解制备大米免疫活性肽的最佳工艺条件为温度41℃、加酶量2940 U/g、酶解时间1.9 h、pH7.5、料液比5%,此条件下RPHs的SI值为1.418(125 ug/mL)。论文进一步通过膜分离和多种色谱分离对大米蛋白胰蛋白酶酶解物进行分离纯化。首先顺次采用超滤(UF)、纳滤(NF)和反渗透(RO)膜分离装置对RPHs进行了分子量分级、脱盐、浓缩处理,考察了温度、压力、料液浓度对UF、NF和RO过程中膜通量的影响,确定了对RPHs进行UF、NF及RO处理的较佳工艺条件,其中UF的较佳工艺条件为操作压力0.35 MPa、操作温度20℃、RPHs浓度30 g/L;NF的较佳工艺条件为操作压力0.7 MPa、操作温度25℃、RPHs浓度30 g/L;RO的较佳工艺条件为操作压力0.8 MPa、操作温度25℃、RPHs浓度30 g/L。然后以小鼠巨噬细胞SI值为考察指标,分别顺次采用DA201-C大孔吸附树脂、001×7型强阳离子交换树脂、Sephadex G-10凝胶色谱、NGCTM中高压层析与反相高效液相色谱(RP-HPLC)5种色谱方法对RPHs进行了分离纯化。确定了DA201-C大孔吸附树脂色谱分离RPHs的条件为上样流速0.5 BV/h、上样浓度20 mg/mL、洗脱流速1.0BV/h,以20%、40%、60%、80%的乙醇进行阶段洗脱,将RPHs分为5个组分,其疏水值依次为90.0、120.5、191.9、235.3;与RPHs相比,洗脱组分RPHs-B和RPHs-C的SI值显著提高(P<0.05),其中RPHs-C的SI值为1.594(125μg/mL)。采用001×7强阳离子交换树脂色谱、以pH阶段洗脱对RPHs-C进行分离纯化,获得5个组分,其中SI值最高(1.211,62.5μg/m L)的是RPHs-C-7组分,与RPHs-C组分相比,其SI值有极显著提高(P<0.01)。采用Sephadex G-10色谱对RPHs-C-7进行进一步分离纯化,获得的3个组分中RPHs-C-7-3的SI最高(1.252,62.5μg/mL),与RPHs-C-7组分相比,其SI值有极显著提高(P<0.01)。采用NGCTM中高压层析对RPHs-C-7-3组分进行分离纯化,与RPHs-C-7-3组分相比,所得组分25、26、27、28、31、36、37、39、40、41的SI值均有极显著提高(P<0.01)。采用RP-HPLC对组分RPHs-C-7-3-28、RPHs-C-7-3-31进行分离纯化,与组分RPHs-C-7-3相比,不仅其SI值有极显著提高,且两个组分纯度也较高,其主峰面积分别为88.73%和89.44%。经酶解工艺优化和顺序采用大孔吸附树脂色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、NGCTM中高压液相色谱与反相高效液相色谱分离纯化,在SI相当的情况下,所需大米蛋白胰蛋白酶酶解物浓度可降低32倍。
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