论文部分内容阅读
研究目的:以iNKT细胞表面的CD28/CD80信号通路为切入点,通过体外实验观察中药软肝饮对HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞免疫功能的影响,探究iNKT细胞在软肝饮治疗HBV转基因小鼠时发挥的调节作用与软肝饮通过调控iNKT细胞治疗HBV转基因小鼠的分子机制,为软肝饮在临床中治疗慢乙肝的应用提供实验研究支持。研究方法:将体外分离制备的HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞培养于RPMI-1640培养基中,选取适量细胞加入anti-CD28活化性抗体培养72小时以激活CD28/CD80信号通路,通过MTT法选择最佳的给药浓度及干预时间,给予部分细胞适宜浓度的软肝饮干预。后将培养基中细胞分成4个处理组:空白对照组（单纯培养基组）、anti-CD28激活剂组、软肝饮组、anti-CD28激活剂+软肝饮组,各组均在5%CO2 37℃及饱和湿度条件下的培养。观察各组iNKT细胞增殖功能以及相关信号分子的表达,通过免疫荧光法测CD28、CD80的表达;q RT-PCR法检测HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞CD28、CD80、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的m RNA表达;Western Blot检测HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞CD28、CD80、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的蛋白表达。研究结果:1、在MTT法检测软肝饮最佳干预浓度和干预时间中:在作用时间相同的情况下,10%浓度的含药血清对HBV转基因小鼠iNKT细胞的增殖能力强于2.5%、5%、15%、20%浓度的含药血清;而25%、30%浓度含药血清对iNKT细胞有毒性抑制作用。在给药浓度相同的情况下,作用24h比作用48h及72h后的细胞活力更强。结合实验结果,选择10%含药血清作用24h作为软肝饮最佳给药浓度及干预时间。2、在免疫荧光法测HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞表面CD28、CD80的表达中:（1）与空白对照组相比,anti-CD28激活剂组、软肝饮组、anti-CD28激活剂+软肝饮组HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞CD28荧光增强,表达上调;其中软肝饮组、anti-CD28激活剂+软肝饮组HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞CD28荧光明亮,CD28显著上调。（2）与空白对照组相比,anti-CD28激活剂组、软肝饮组、anti-CD28激活剂+软肝饮组HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞CD80表达无明显变化。3、在q RT-PCR法检测HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞CD28、CD80、IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-10的m RNA表达中:（1）与空白对照组相比,anti-CD28激活剂组、软肝饮组、anti-CD28激活剂+软肝饮组HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞CD28的m RNA表达均显著上调（P＜0.01）。anti-CD28激活剂+软肝饮组与anti-CD28激活剂组、软肝饮组相比,HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞CD28的m RNA表达有一定的上调,差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）与空白对照组相比,anti-CD28激活剂组、软肝饮组、anti-CD28激活剂+软肝饮组HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞CD80的m RNA表达无明显变化,差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）与空白对照组相比,软肝饮组HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-10的m RNA表达及anti-CD28激活剂组HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞IL-2、IL-4的m RNA表达均有一定上调,差异有统计学意义（P＜0.05）;anti-CD28激活剂组HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞IFN-γ、IL-10的m RNA表达及anti-CD28激活剂+软肝饮组HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞IL-2、IL-4、IFN-γIL-10的m RNA表达均显著上调（P＜0.01）。anti-CD28激活剂+软肝饮组与anti-CD28激活剂组、软肝饮组相比HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-10的m RNA表达均有一定的上调,差异有统计学意义（P＜0.05）。4、在Western Blot检测HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞CD28、CD80、IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-10的蛋白的表达中:（1）与空白对照组相比,anti-CD28激活剂组、软肝饮组、anti-CD28激活剂+软肝饮组HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞表面CD28蛋白表达升高,有一定差异（P＜0.05）。anti-CD28激活剂+软肝饮组与anti-CD28激活剂组、软肝饮组相比,HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞表面CD28蛋白表达无明显变化,差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）与空白对照组相比,anti-CD28激活剂组、软肝饮组、anti-CD28激活剂+软肝饮组HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞表面CD80蛋白表达无明显变化,差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）与空白对照组相比,anti-CD28激活剂组、软肝饮组HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞IL-4蛋白表达及anti-CD28激活剂组、软肝饮组、anti-CD28激活剂+软肝饮组HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞IL-10蛋白表达均升高,有一定差异性（P＜0.05）;anti-CD28激活剂组、软肝饮组、anti-CD28激活剂+软肝饮组HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞IL-2、IFN-γ蛋白表达及anti-CD28激活剂+软肝饮组HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞IL-4蛋白表达均显著升高（P＜0.01）。anti-CD28激活剂+软肝饮组与anti-CD28激活剂组、软肝饮组相比,HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-10蛋白表达均升高,有一定差异性（P＜0.05）。结论:1、CD28/CD80信号通路是中药软肝饮抗HBV作用的潜在分子靶点之一;2、中药软肝饮治疗CHB的机制或许与激活CD28/CD80信号通路、调控iNKT细胞功能有关;3、中药软肝饮能够激活HBV转基因小鼠肝脏iNKT细胞调控IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-10的水平,达到抑制HBV的效果。