组蛋白磷酸化是组蛋白表观修饰方式之一。组蛋白H3第三位苏氨酸的磷酸化修饰是细胞有丝分裂期的标志性事件,磷酸化的H3T3能招募CPC复合物于着丝粒,CPC复合物通过对下游众多蛋白底物的磷酸化,调控姐妹染色单体的分离、纺锤体的组装和维持、胞质分裂等行为。Haspin是催化H3T3磷酸化的激酶,作为一种组成活化型酶,Haspin在有丝分裂间期无活性,进入分裂期后,CDK1、PLK1和Aurora B激酶通过对Haspin N端多个位点的磷酸化修饰,激活Haspin。对H3T3进行脱磷酸化的酶是Repo-Man/PP1γ复合物,Repo-Man是一种染色体脚手架蛋白,通过与PP1γ形成复合物脱磷酸化H3T3。在有丝分裂前中期,Repo-Man/PP1γ与Haspin的功能相互拮抗,使H3T3的磷酸化只发生于着丝粒上。已有研究表明,与野生型H3转基因果蝇相比,H3T3A突变体转基因果蝇中H3T3的磷酸化显著降低,但其作用机制尚不清楚。前期结果表明,Haspin的催化结构域与多聚核小体孵育时,在起始阶段,反应的速度比较慢,反应开始后,随着酶浓度的增加,反应速度并不增强,反应的速度可能只与Haspin在多聚核小体上的移动速度有关。当Haspin的催化结构域与H3单体孵育时则表现为经典的米氏反应,随着酶浓度和底物浓度的增加,反应速度逐渐增强。据此推测,Haspin可能以一种持续性机制催化H3T3的磷酸化。在前期研究的基础上,本课题以人类Haspin蛋白为研究对象,进一步探讨H3T3A对人类组蛋白H3T3磷酸化的影响及作用机制。持续性催化机制是指酶结合到多反应位点的大分子底物后酶分子一直保持与底物结合的状态直到催化完所有可能的位点才从底物解离。本研究中,我们采用了Time course和Start-Trap两种方法分析Haspin是否是持续性催化模型。Time course实验表明:当使用两种形式的Haspin(MBP-Haspin-HBIS-Deletion、His₆-Haspin_492-798)分别与三种形式的H3底物（H3单体、鸡核小体、重构核小体）在体外孵育时,随着酶浓度的提高,催化反应速率增强,H3T3磷酸度程度提高,并不支持持续性催化反应模型。Start-Trap实验表明,在反应中途加入抑制剂H3（2-25）短肽后,会抑制反应的速度和H3T3磷酸化程度,说明抑制剂加入后会与游离的Haspin结合,终止反应。因此我们推测Haspin可能不是持续性激酶。体外激酶反应体系的稀溶液与细胞内环境存在较大差异,Haspin的体外酶动力学反应可能与细胞内的反应机制存在差异。因此,我们使用Tet-on系统构建了HEK293T和HeLa细胞的H3及H3T3A诱导型稳转细胞株,检测H3T3A掺入染色体后对内源性H3T3ph的影响。免疫印迹实验结果表明:在HEK293T细胞和HeLa细胞中,H3T3A掺入染色体后,内源性H3T3ph、H3S10ph均显著降低,Haspin的磷酸也有显著降低。使用PP1和PP2A磷酸酶抑制剂M-LR和冈田酸处理后,H3T3ph和Haspin的磷酸化有所恢复,而使用PP2A的抑制剂LB-100,并不影响H3T3和Haspin的磷酸化。据此,我们推测H3T3A突变体掺入到正常的染色体上后,可能通过某种未知机制促进PP1的活性,进而促进Haspin或AuroraB的脱磷酸化,抑制H3T3的磷酸化途径,激活H3T3的脱磷酸化途径,最后导致H3T3磷酸化水平的剧烈降低。