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陕北白绒山羊是绒肉兼用型的地方培育品种,其皮肤次级毛囊所生长的毛发纤维(羊绒)因其优良的性状而具有极高的经济价值。miRNA是一类在大多数情况下结合在靶基因3’-UTR区引起靶基因降解或抑制mRNA翻译,进行转录后调控的非编码小分子。研究表明多种miRNAs对毛囊周期性发育过程进行调控,然而对于miRNAs如何调控陕北白绒山羊绒毛生长发育相关机制尚不清楚。本课题组前期对绒山羊毛乳头细胞和毛乳头来源外泌体的miRNAs测序分析发现miR-1在外泌体中特异性表达,且表达量较高。为了解析miR-1对绒山羊皮肤毛囊干细胞(HFSCs,Hair follical stem cells)生长发育的影响,本研究利用相关分子生物学手段来探究miR-1在毛囊周期性发育中的作用机理。试验过程及具体结果如下:1.过表达miR-1后,分别利用CCK8、EdU和流式细胞仪检测细胞周期技术来探究miR-1对陕北白绒山羊HFSCs增殖、凋亡等的调控作用。结果表明,过表达miR-1后HFSCs增殖能力显著减弱(p<0.01),处于S期的细胞比例显著减少(p<0.01),而处于G0-G1期的细胞比例显著增加,表明细胞被阻滞在了G0-G1期。以上结果表明miR-1的过表达会抑制HFSCs的增殖。2.qPCR及Western blot检测miR-1对HFSCs增殖分化信号通路的影响。结果表明,过表达miR-1后,细胞增殖标记基因KI67和PCNA,以及AKT的mRNA和蛋白表达水平均显著低于对照组(P<0.05),表明miR-1的过表达抑制了HFSCs中细胞增殖标志基因KI67、PCNA的表达,并通过调控AKT通路来抑制HFSCs的增殖;与NC组相比,mimics组K6、S100A3和Notch1的mRNA和蛋白表达水平均显著高于对照组(P<0.05),表明HFSCs中miR-1的过表达促进了细胞分化标志基因K6和S100A3的表达,并通过激活Notch通路来促进HFSCs分化。3.利用RNAhybrid和TargetScan 7.1软件对miR-1的靶基因进行预测,根据预测结果克隆候选靶基因靶位点所在的3’-UTR区,并成功构建了miR-1候选靶基因FOXP1、FOXC1、IGF1R、SOX9、MSI2和LEF1的野生型和突变型的双荧光素酶报告载体。将miR-1 mimics与野生型/突变型载体质粒共转染293T细胞,双荧光素报告基因实验显示miR-1能抑制野生型IGF1R和LEF1的靶位点报告载体的荧光素酶活性,但是靶基因结合位点突变后,IGF1R和LEF1被抑制的荧光素酶活性恢复,而FOXP1、FOXC1、SOX9、MSI2的荧光素酶活性仍然显著抑制,表明miR-1与IGF1R和LEF1基因的3’UTR具有靶向关系。综上所述,miR-1能够有效调节绒山羊HFSCs的增殖与分化过程,为进一步研究陕北白绒山羊毛囊周期性发育提供了一定的理论基础。