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狂犬病(Rabies)作为最古老的传染病之一,是由狂犬病病毒(Rabies Virus,RABV)引起的人兽共患中枢神经系统传染病,分布于世界大部分地区。我国每年死于狂犬病的人数居世界第二位及全国各类传染病死亡人数的前五位,其中95%以上的病例是因直接或间接接触患病或带毒的动物引发的。目前,狂犬病发病后的临床治疗仍是一个世界性难题,其致死率高达100%,尚无有效的治疗手段。数据显示,70%以上犬的免疫覆盖率可以有效控制人间狂犬病,因此,动物的免疫预防成为遏制人类狂犬病最为有效的措施。当前用于动物狂犬病免疫的疫苗主要为安全的灭活疫苗,但价格昂贵,并需多次免疫才能获得良好的长期保护,阻碍了其在发展中国家的广泛应用。因此,发展低毒、单剂量及长期有效的狂犬病疫苗对控制狂犬病具有重要意义。近来研究表明,过表达树突状细胞(Dendritic cells,DCs)刺激因子的重组狂犬病病毒可在淋巴结及外周血中招募并成熟DCs及B淋巴细胞,进而迅速产生显著高水平的抗病毒中和抗体(Virus-neutralizing antibodies,VNA),但其有效持续时间短。当前,尚未有研究通过应用免疫记忆的作用机制来延长狂犬病疫苗诱导的体液免疫。本研究通过反向遗传技术,在弱毒疫苗株r LBNSE的基础上过表达对免疫细胞的生长、存活及分化方面具有广泛效应的白介素-7(Interleukin-7,IL-7),并拯救获得重组狂犬病病毒(r LBNSE-IL7)。在确定r LBNSE-IL7的体外生长特性不因外源基因IL-7的插入而受到影响之后,通过ELISA检测重组病毒感染细胞上清中IL-7的表达,发现只有rLBNSE-IL7以剂量依赖形式表达IL-7,并对细胞无明显副作用。将r LBNSE-IL7在BSR细胞中连续传代10次,各代次均保持IL-7的稳定遗传。为鉴定IL-7的表达对狂犬病病毒致病性的影响,将rLBNSE、rLBNSE-IL7以及阴性对照重组病毒rLBNSE-IL7(-)脑内途径感染免疫功能完全和不完全的小鼠。我们发现脑内高表达的IL-7能够限制病毒在脑内的转录和复制,进一步减弱狂犬病病毒的致病力,而非IL-7的插入造成病毒基因组长度的增加所导致。为进一步分析IL-7对狂犬病病毒免疫原性的作用,将重组病毒后肢肌肉途径免疫小鼠,进行依赖T细胞的与B细胞相互作用的相关免疫机制研究。与亲本病毒r LBNSE相比,重组病毒表达的IL-7可以显著增加淋巴结中滤泡性T辅助细胞(T follicular helper cells,Tfh cells)、生发中心B细胞(Germinal center cells,GC B cells)、长寿命记忆性B细胞(Memory B cells,Bmem)的数量和骨髓中长寿命浆细胞(Plasma cells,PCs)的比例。由单剂量免疫rLBNSE-IL7所增殖的长寿命PCs可产生更加强大的免疫效力,维持显著高水平的VNA和相关抗体亚类长达360天,且能够长期有效保护绝大多数小鼠抵抗强毒株攻击。此外,IL-7所增加的长寿命Bmem能够于再次共同免疫r LBNSE后,分化成抗体分泌细胞,迅速产生更高水平的VNA及相应抗体亚类。上述结果表明IL-7促进了Tfh细胞的增殖,并在其协助下增强了GCs反应,进一步生成与维持免疫记忆相关的长寿命Bmem和PCs,从而增强了机体针对狂犬病病毒的特异性初次免疫反应和再次免疫应答。综上所述,本研究成功构建了表达IL-7的重组狂犬病病毒r LBNSE-IL7,鉴定了外源基因IL-7在病毒基因组中的表达不影响病毒的体外生长特性;且脑内高表达的IL-7可以降低狂犬病病毒的致病力;并通过促进GCs中的Tfh细胞与B细胞的相关免疫反应从而增殖长寿命Bmem和PCs以增强狂犬病病毒的免疫记忆,改善初次免疫保护性反应和再次免疫应答。此研究结果表明rLBNSE-IL7具有成为低毒、高效的动物狂犬病疫苗的潜能。