β-甘露聚糖酶的生产纯化和性质研究

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甘露聚糖是软木和广泛分布在植物组织中半纤维素的主要成分。主要的甘露聚糖降解酶是β-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶和β-葡糖甘酶。β-甘露聚糖酶是起主要作用的水解酶,攻击甘露聚糖主链内部的糖苷键,释放短的β-1,4-甘露低聚糖。从山东省工业微生物菌种保藏中心的7株芽孢杆菌为实验材料,用培养基透明圈法从7种芽孢杆菌中筛选到酶活最高Bacillus subtilis S-88、高龙枯草芽孢杆菌w-0313.83、地衣芽孢杆菌3.83。用测定发酵液酶活的方法进行菌株的复筛,筛的酶活最高的菌株为Bacillus subtilis S-88且酶活力为907.486mg/mL·min。该菌产酶条件进行了单因素实验发酵条件的优化,最优产酶条件为:最佳碳源是魔芋粉,含量为4%,最佳有机氮源为酵母浸粉,最佳无机氮源为硝酸钠,经过氮源的经济性评价得到最优有机氮源为玉米黄粉,最优无机氮源为硫酸铵,最佳产酶时间为36h。本文用Bacillus subtilis S-88以魔芋粉为底物,生产β-甘露聚糖酶。并通过梯度硫酸铵盐析、离心、AKTA脱盐柱脱盐、阴离子交换树脂、G-75凝胶电泳等的手段分离得到纯化的酶,最终测得比酶活为61697.52IU mL-1。通过SDS-PAGE测得纯化得到的为电泳纯的蛋白,分子量为30kda且其分子量远远小于细菌产的β-甘露聚糖酶分子量(50kda)。最后对Bacillus subtilis S-88产的β-甘露聚糖酶的性质进行了检测。该酶的最适反应温度为55℃、最适反应pH为6.0。细菌产β-甘露聚糖酶最适pH多在5.5-7.0之间而该酶在pH4.4-6.8之间比较稳定,有比较宽的pH稳定范围,有很好的耐酸性,且该酶的最稳定测定pH为6.0。Bacillus subtilis S-88分泌的β-甘露聚糖酶在55℃以下,保温2h酶活几乎不变,55℃时剩余94.87%。因此,该酶的稳定温度是小于55℃。此外,此β-甘露聚糖酶在沸水浴10min以内残余酶活在60%以上,粗酶液需要灭活70min以上才能将其完全灭活。说明此β-甘露聚糖酶具有良好的耐高温特性。镁离子能够促进β-甘露聚糖酶的活性,金属离子螯合剂EDTA能够抑制β-甘露聚糖酶的活性,而一定浓度的其他金属离子对其也有一定的抑制。Bacillus subtilis S-88产的内切水解酶β-甘露聚糖酶不能彻底水解底物,产生大量的低聚糖并且伴随着少量的单糖和二糖的产生。所有的这些性质为工业化生产β-甘露聚糖酶提供了有效的数据。
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