广州管圆线虫是引起嗜酸粒细胞增多性脑膜炎和脑膜脑炎的重要病原体。人是广州管圆线虫的非适宜宿主,多因生食或半生食含有广州管圆线虫Ⅲ期幼虫的中间宿主而感染。感染期幼虫可穿过肠壁进入血液循环系统,随血流在体内移行,具有嗜神经性,多侵犯中枢神经系统。该病的特征为脑脊液中嗜酸性粒细胞升高,病变除了大脑和脑膜还可波及小脑、脑干、脊髓或眼球,主要的病变有脑充血、出血、脑组织机械性损伤及肉芽肿反应。近些年来由于广州管圆线虫中间宿主福寿螺和褐云玛瑙螺在我国南方地区大量繁殖,加上人们饮食上嗜好生猛鲜活与猎奇,导致广州管圆线虫病相继在各地暴发或散发流行,已被列入新发感染性疾病。目前临床上常用阿苯达唑驱虫,但是虫体死亡时崩解释放大量的抗原引起的炎症反应会导致神经系统症状的加重。因此,深入了解广州管圆线虫感染脑损伤的免疫应答机制对于广州管圆线虫病的防治具有重要意义。研究表明中枢神经系统和免疫系统以复杂的方式双向相互作用。在理想的情况下,应激条件下的炎症和抗炎反应是平衡的,有利于创伤愈合和遏制病原体,同时防止过高的炎症反应或严重的免疫抑制。然而,在没有全身性炎症的情况下,脑损伤局部炎性细胞因子扩散触发的抗炎反应可能是有害的,因为这样会下调机体的防御机制,使机体容易受到感染。有研究发现,中枢神经系统损伤对免疫功能产生深远的影响,如中风,创伤性脑损伤或脊髓损伤后的患者均表现出免疫功能受损,包括外周血淋巴细胞数量减少,脾脏和胸腺萎缩,T细胞活性受损等。进一步研究发现,急性中枢神经系统受损患者循环单核细胞主要组织相容性复合体II类分子表达下调,体外内毒素刺激单核细胞,其产生促炎性细胞因子的能力大大降低。这种免疫抑制的临床表现为在脑损伤后的不久高发全身性感染,特别是肺炎和尿路感染,而感染会阻碍神经的恢复、增加患者死亡率。这些研究结果提示,脑损伤会导致外周免疫抑制。广州管圆线虫的幼虫侵入人体后移行至大脑,可造成脑组织机械损伤,占位并释放代谢产物损伤中枢神经系统。基于脑部损伤与外周免疫抑制的密切联系,我们提出如下假说：广州管圆线虫幼虫侵入大脑损伤中枢神经系统后,导致大脑局部炎性细胞因子扩散刺激抗炎反应引起外周免疫抑制,增加机体的继发感染的机会。为了验证上述假说,在小鼠广州管圆线虫感染模型上,我们首先观察了广州管圆线虫感染后免疫器官胸腺和脾脏的变化,同时对外周淋巴细胞亚群数量和功能的变化进行了评估；其次,我们从细胞凋亡和细胞发育受阻两方面探讨了广州管圆线虫感染后外周淋巴细胞数量下降的原因；再次,我们研究了广州管圆线虫感染后脑组织炎性细胞因子、抗炎细胞因子和趋化因子的表达,观察中枢神经系统与外周免疫系统联系的下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的变化；最后,我们证实在广州管圆线虫感染中枢神经系统损伤后,糖皮质激素促进了外周的免疫抑制。本研究获得如下主要结果：1.广州管圆线虫感染诱导免疫器官萎缩和淋巴细胞数量减少感染后21天小鼠的胸腺和脾脏较对照组小鼠明显萎缩,且单个核细胞数也减少,提示广州管圆线虫感染可影响小鼠的免疫器官。为了探讨感染后胸腺和脾脏萎缩的原因,我们用流式细胞仪检测了小鼠脾脏和外周血细胞亚群的变化。检测结果表明,感染后脾脏和外周血中B细胞、T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、Thl细胞及NK细胞的数量较对照组显著减少。2.广州管圆线虫感染降低细胞免疫和体液免疫功能为了证实在广州管圆线虫感染后,淋巴细胞的免疫功能也受感染的影响,我们进一步研究了T淋巴细胞增殖功能、分泌细胞因子和B细胞产生抗体的能力。结果显示,感染后小鼠T细胞的增殖能力较对照组小鼠降低；采用有丝分裂原刺激外周全血细胞,其培养上清用ELISA检测的结果显示,广州管圆线虫感染诱导低水平的IFN-γ、TNF-α和高水平的IL-4;用非特异性抗原OVA免疫广州管圆线虫感染小鼠和对照组小鼠,检测OVA-IgGl抗体表达水平。检测结果显示,感染后小鼠体内OVA-IgGl抗体水平较对照小鼠降低,提示广州管圆线虫感染降低了小鼠B细胞产生抗体的能力。为了进一步证实这些结果,我们观察了小鼠肺部的病理和采集小鼠的血液做菌血培养。结果显示,感染后小鼠肺部有大量炎性细胞浸润,表现为肺炎。同样血液在血琼脂平板上培养显示感染后出现菌血症,表明广州管圆线虫感染诱导了小鼠免疫抑制。3.广州管圆线虫感染增强NK细胞的杀伤功能 因为广州管圆线虫感染降低了细胞免疫和体液免疫功能,导致小鼠的感染风险增加,所以我们进一步评估了广州管圆线虫感染对NK细胞功能的影响。我们在加或不加外源性IL-12的条件下对NK细胞刺激培养24 h, ELISA检测培养上清中IFN-γ和TNF-α的表达水平。结果表明,IL-12处理的感染小鼠NK细胞较对照小鼠产生更高水平的IFN-γ。无论是否存在外源性IL-12,广州管圆线虫感染小鼠和对照小鼠均只能诱导NK细胞产生低水平的TNF-β。进一步我们评估了感染对NK细胞杀伤活性的影响,结果显示,感染后的NK细胞较对照组小鼠有更强的杀伤功能。这些结果提示,广州管圆线虫感染虽然降低了NK细胞的数量,但是增强了NK细胞的杀伤功能。4.广州管圆线虫感染后B细胞和T细胞的减少不是由于凋亡所导致,但NK细胞在感染后出现大量的凋亡感染后B和T细胞数量急剧降低,为了进一步明确细胞数量下降是否由凋亡所致,我们用流式检测了这些细胞表面7AAD-AnnexinV+的比例。结果发现,与对照组相比,感染后细胞表面7AAD" Annexin V+比例没有增加。Caspase 3作为凋亡最终的执行者,是检测凋亡的一个重要指标。为了进一步证实这个结果,我们用磁珠分选的方法分选出B220-细胞和CD3-细胞,用estern blot的方法检钡Cleaved Caspase 3的表达,结果表明感染后没有检测至Cleaved Caspase 3表达的增加,提示广州管圆线虫感染后B细胞和T细胞数量的下降不是由于凋亡所导致的。同样地,为了明确NK细胞数量下降是否由凋亡所致,我们用流式检测了NK细胞表面7AAD" Annexin V+的比例及用磁珠分选的方法分选出DX5+细胞,用estern blot的方法检狈Cleaved Caspase 3的表达。结果发现,与对照组相比,感染后NK细胞表面7AAD- Annexin V+和Cleaved Caspase 3的表达增加,提示广州管圆线虫感染导致NK数量的降低与NK细胞发生的凋亡有关。5.广州管圆线虫感染抑制骨髓中B细胞的发生和损伤T细胞在胸腺的发育广州管圆线虫感染后B细胞数量的降低不是由于细胞凋亡所引起的,我们推测在B细胞的发育的过程中,是否所有或部分发育B细胞亚群有损失。为了验证这一猜想,我们检测了骨髓发育中B细胞的比例。结果所示,感染后骨髓发育中B细胞的比例较对照组降低,进一步,我们分析了骨髓发育中B细胞的两个亚群：pro-/pre-B细胞和不成熟B细胞。结果表明：感染后骨髓中pro-/pre-B细胞占发育中B细胞的比例较对照组显著降低；而感染后骨髓中不成熟B细胞占发育中B细胞比例较对照组上升,提示广州管圆线虫感染导致骨髓发育中B细胞下降,其中受主要影响的是pro-/pre-B细胞。我们知道pro-/pre-B细胞在Ig H链和L链基因重排后,骨髓中的发育中B细胞进入到不成熟B细胞阶段,然后迁移到外周进入到过渡期B细胞。进一步我们检测了脾脏中发育中B细胞和成熟B细胞的比例,结果显示感染后21天,成熟B细胞降低。同时,脾脏发育中B细胞的比例较对照组显著降低。进一步,我们分析了发育中B细胞的3个阶段亚群：TR1、TR2和TR3亚群。结果表明,随着感染时间的增加,TR1占发育中B细胞的比例逐步降低。TR2和TR3占发育中B细胞的比例随着感染时间的增加而增加。提示广州管圆线虫感染导致脾脏发育中B细胞下降,其中受主要影响的是TR1细胞亚群。综合以上结果,提示由于广州管圆线虫感染影响B细胞的发生,从而导致B细胞输出下降。广州管圆线虫感染后T细胞数量的降低同样不是由细胞凋亡所引起,并且在感染后胸腺出现严重的萎缩,我们推测是否T细胞在胸腺的发育过程受阻。为此我们用流式细胞仪检测了胸腺T细胞亚群,结果显示感染后CD4+CD8+T细胞的比例较对照组降低,与之相反的是随着感染时间的增加,CD4-CD8-T细胞、CD4+CD8-T细胞和CD4-CD8+T细胞的比例较对照组显著增高。进一步我们观察了胸腺各T细胞亚群的数量,结果显示,感染后CD4CD8T细胞和CD4"CD8+T细胞的数量较对照组没有差异；但是感染后CD4+CD8+T细胞的数量较对照组显著降低。为了进一步明确其细胞数量下降是否由凋亡所致,我们用流式检测了CD4+CD8+T细胞表面7AAD" Annexin V+的表达。结果表明,与对照组相比,感染后CD4+CD8+T细胞表面7AAD-Annexin V+比例逐步增加。综合以上结果,提示广州管圆线虫感染后胸腺细胞数量减少和外周T细胞数量的减少与CD4+CD8+T细胞凋亡后减少有关。6.广州管圆线虫感染导致的脑损伤引起淋巴细胞数量减少和下丘脑-垂体-肾上腺轴的活化广州管圆线虫幼虫移行进入脑内,侵犯神经系统,破坏脑组毛织。为了明确广州管圆线虫感染导致的淋巴细胞数量的降低是否由于脑损伤导致,我们采用阿苯达唑杀虫实验观察感染后杀虫对外周淋巴细胞亚群的影响。结果表明,杀虫处理组在感染后21天胸腺和脾脏大小较正常对照组没有显著的差异。感染后杀虫脾脏淋巴细胞亚群B细胞、T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞的比例较正常对照组也没有显著差异,提示广州管圆线虫感染后外周出现免疫抑制发生在幼虫富集于脑组织导致CNS损伤之后,也即是感染导致的脑损伤诱导了外周的免疫抑制。为了明确广州管圆线虫脑损伤后的外周免疫抑制是否与下丘脑-垂体-肾上腺轴的活化从而引起糖皮质激素分泌增加有关,我们检测了下丘脑-垂体-肾上腺轴活化的指标。结果发现,感染后血浆中皮质酮含量的表达较对照组相比显著增加；小鼠海马、下丘脑室旁核、垂体和肾上腺c-fos mRNA的表达水平显著增加；下丘脑室旁核中促肾上腺皮质激素释放激素和肾上腺中肾上腺酪氨酸羟化酶的mRNA的表达水平较对照组表达水平显著增加。以上结果提示,广州管圆线虫感染会导致下丘脑-垂体-肾上腺轴的活化。7.广州管圆线虫感染后阻断糖皮质激素受体可部分逆转B细胞发育的停止,但不能逆转受损的胸腺T细胞的发育为了进一步明确下丘脑-垂体-肾上腺轴活化后释放的糖皮质激素对外周免疫细胞的发育,我们用糖皮质激素受体阻断剂阻断下丘脑-垂体-肾上腺轴并观察感染后B细胞和胸腺T细胞的发育。我们先观察了骨髓中B细胞的发育,结果发现,糖皮质激素受体阻断剂RU486处理感染组骨髓发育中B细胞的比例较溶剂处理感染组增加。进一步,我们分析了发育中B细胞的两个亚群：pro-/pre-B细胞和不成熟B细胞。结果表明,RU486处理感染组pro-/pre-B细胞占发育中B细胞的比例较溶剂处理感染组显著增加；RU486处理感染组不成熟B细胞占发育中B细胞比例较溶剂处理感染组无显著差异。进一步观察脾脏中B细胞的发育,结果显示,RU486处理感染组脾脏发育中B细胞的比例较溶剂处理感染组增加。以上结果提示广州管圆线虫感染导致下丘脑-垂体-肾上腺轴活化释放的糖皮质激素,与B细胞发育受阻从而导致B细胞输出下降有关。除了评价阻断下丘脑-垂体-肾上腺轴对B细胞发育的影响,我们同时检测RU486阻断下丘脑-垂体-肾上腺轴对胸腺T细胞发育的影响。结果发现, RU486处理感染组胸腺CD4+CD8+T比例较溶剂处理感染组无显著差异。提示RU486阻断下丘脑-垂体-肾上腺轴并不能逆转CD4+CD8+T比例的降低,胸腺T细胞发育受阻可能是下丘脑-垂体-肾上腺轴活化之外的机制所导致。综上所述,本研究证实了广州管圆线虫感染后引起的脑损伤会对免疫系统产生抑制效应,并初步阐明下丘脑-垂体-肾上腺轴活化在其中的效应机制。研究结果进一步丰富了对广州管圆线虫病致病机制的认识,也对指导广州管圆线虫病的临床治疗,提供了重要的参考依据。