血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)异常增殖是高血压血管重塑和血管再狭窄等血管增殖性疾病共同的细胞病理学基础。血管紧张素II(Ang II)具有强效的促进VSMC增殖的活性。Ang II与细胞膜上的Ⅰ型受体(AT1R)结合后可激活MAPK、JAK-STAT和PKC等多条信号途径,这些信号途径通过激活细胞增殖相关基因表达而发挥促细胞增殖的作用。Krüppel样因子(Krüppel-like factor,KLF)是一类含锌指结构的转录因子家族,主要参与调节细胞发育、分化、增殖和凋亡等过程。KLF家族中的KLF5是一种促细胞增殖转录因子,在血管重塑中起重要作用。c-jun是早期原癌基因,通过与TPA反应元件相互作用,参与多种细胞增殖相关基因的转录调节。我们实验室前期研究发现,在Ang II促细胞增殖过程中伴随着KLF5和c-Jun表达增加。细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A, p21)是CDK抑制剂,可通过抑制DNA合成使细胞停滞在G1期。我们推测,KLF5和c-Jun对VSMC增殖的影响除与细胞周期进展基因有关外,也可能涉及到CDK抑制剂,为此我们选择p21为靶基因,研究KLF5和c-Jun在p21基因转录激活中的作用及其调节方式,从而揭示二者在p21基因表达调控过程中扮演的角色及相互关系。方法:用Western blot分析检测KLF5、c-Jun和p21表达以及不同信号转导分子的磷酸化变化;免疫共沉淀检查KLF5与c-Jun之间的相互作用;报告基因分析检测KLF5和c-Jun对p21基因表达的影响;细胞免疫荧光染色观察KLF5在细胞分布中的定位;流式细胞光度术分析细胞周期各时相的分布情况。结果:1 Ang II促进VSMC细胞周期的进程流式细胞术分析结果显示,与对照组相比,Ang II于作用VSMC 6、12、24 h后,G1期细胞数量减少,S期细胞数量增加,表明VSMC在Ang II作用下增殖活性明显升高。提示,Ang II可加快VSMC细胞周期进程,促进VSMC增殖。2 Ang II诱导KLF5和c-Jun表达,抑制p21表达Western blot结果显示,100 nM Ang II刺激VSMC不同时间和不同浓度Ang II刺激细胞12 h,KLF5和c-Jun的表达水平呈剂量和时间依赖性的增高。而p21的表达水平则呈时间和剂量依赖性降低,提示Ang II对VSMC的促增殖效应涉及到了KLF5、c-Jun和p21。细胞免疫荧光染色结果显示,在静止的VSMC中,KLF5在胞浆和胞核均有分布。Ang II刺激6 h后,KLF5出现核转位。刺激12、24 h的细胞,KLF5几乎完全定位于细胞核中。报告基因结果证明,在293A细胞中,过表达KLF5可显著抑制p21启动子指导的报告基因表达活性。以上结果显示,KLF5介导Ang II对p21基因表达的抑制作用。3 KLF5与c-Jun协同抑制p21基因表达上述研究结果显示,Ang II可以诱导KLF5和c-Jun表达,为揭示二者在抑制p21基因表达中的作用及其机制,用免疫共沉淀检测二者的相互作用。结果表明,Ang II刺激1 h后,KLF5和c-Jun之间的结合显著增加,提示,KLF5与c-Jun之间存在物理学上的相互作用,Ang II能够诱导二者之间的相互缔合。用报告基因分析检查KLF5与c-Jun相互作用对p21基因表达的影响时发现,单独过表达c-Jun或KLF5,均可显著抑制报告基因的表达活性,c-Jun和KLF5表达质粒共转染细胞时,报告基因的表达活性比其单独转染时进一步降低。4 Ang II通过诱导KLF5磷酸化而促进KLF5与c-Jun之间的相互作用Ang II作用于VSMC 0.5 h,KLF5的磷酸化水平显著增高,1 h达到高峰,3 h仍维持在较高水平。用Western blot检测不同信号转导分子的磷酸化变化时发现,Ang II可诱导MEK和ERK1/2快速磷酸化。上述结果显示,Ang II可通过诱导KLF5磷酸化而促进KLF5与c-Jun之间的相互作用。5 ERK抑制剂PD98059抑制Ang II诱导的KLF5磷酸化为进一步证明Ang II诱导的KLF5磷酸化与ERK1/2信号通路激活有关,用ERK抑制剂PD98059预处理VSMC 2 h后,再用Ang II刺激细胞不同时间。免疫沉淀结果显示,用50μM PD98059预处理VSMC后,再用Ang II刺激,与Ang II刺激组相比,KLF5磷酸化水平显著降低。转染持续活化型MEK表达质粒pCMV-MEK1后,KLF5磷酸化水平显著升高。从正反两方面证明,Ang II诱导KLF5磷酸化活化与ERK1/2通路激活有关。交互免疫共沉淀结果进一步证实,PD98059抑制KLF5和c-Jun之间的相互作用。上述结果进一步证明,Ang II通过激活ERK1/2通路发生KLF5磷酸化。6 Ang II通过ERK1/2信号途径抑制p21启动子活性用c-Jun和KLF5表达质粒共转染细胞时,可显著抑制p21启动子指导的报告基因表达活性。当c-Jun、KLF5和MEK三种表达质粒共转染细胞时,对p21启动子的抑制作用更加明显,在这种情况下,报告基因表达活性仅为对照组的5%;如在c-Jun和KLF5表达质粒转染前用PD98059预处理细胞,则p21启动子活性恢复到对照组水平。该结果表明,Ang II通过ERK1/2通路抑制p21启动子活性。结论:1 Ang II诱导KLF5和c-Jun表达,抑制p21表达。2 KLF5与c-Jun协同抑制p21基因表达。3 Ang II通过ERK1/2通路诱导KLF5磷酸化,进而促进KLF5与c-Jun相互作用。4 Ang II通过ERK1/2通路抑制p21启动子活性。