背景随着现代生活节奏加快以及工作模式转换,失眠或睡眠不足已成为社会常态。据报道,全世界范围内有数百万人处于睡眠限制(Sleep restriction,SR)或潜在SR状态,由此带来诸多健康问题。睡眠-觉醒周期与昼夜节律系统相互作用,共同控制机体的内源时间并调节生理功能和行为。耐力是人体体能的最基本要素之一,对于维持机体健康及保证生活质量至关重要。近年研究发现,SR导致的昼夜节律紊乱是运动耐力下降的独立危险因素。因此,如何纠正由SR引起的耐力下降和昼夜节律紊乱已引起越来越多的关注,迫切需要找到应对的方法。睡眠-觉醒周期是人体最基本的生物节律,充足的睡眠时间和良好的睡眠质量对于消除机体疲劳、恢复体力、增强免疫力等具有重要的作用。SR改变了正常的睡眠-觉醒周期,最直接、最早期的影响便是破坏人体正常的昼夜节律。越来越多的证据表明,SR对机体健康产生不良的影响。首先,SR与代谢性疾病的发生发展密切相关,可增加肥胖和以血糖及甘油三酯增高、胰岛素抵抗、2型糖尿病、心血管疾病等为特征的代谢综合征的发病风险。还有研究表明,SR增强骨骼肌组织中蛋白降解信号通路相关基因表达,引起骨骼肌质量下降,进而导致运动能力降低。同时SR会造成机体免疫功能损害,促进大量的炎性细胞因子分泌,阻碍肌肉损伤修复,导致自主神经功能失调。另外,有研究表明SR引起脑功能受损,导致判断与决策能力下降。因此,睡眠不足会扰乱机体代谢平衡,影响免疫、运动等系统的正常功能,进而影响运动能力。然而,SR导致昼夜节律紊乱引起运动耐力下降的机制尚不清楚,也缺乏有效的防治措施。线粒体是机体的“能量工厂”,产生ATP供机体运动所需。大量研究表明,线粒体生物合成能力减弱引起线粒体功能发生障碍,进而导致运动耐力下降。过氧化物增殖物激活受体γ共激活因子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α,PGC-1α)是调控线粒体生物合成的关键调节因子。腺苷酸活化蛋白酶(Adenosine 5’-monophosphate activated protein kinase,AMPK)和沉默信息调节子1(Silent information regulator 1,SIRT1)作为能量感受器可调节PGC-1α表达,促进骨骼肌组织中线粒体生物合成。研究表明,AMPK和SIRT1不仅可以相互调节,还可以与核心时钟基因昼夜节律运动输出周期(Circadian locomotor output cycles kaput,CLOCK)/脑和肌肉组织芳香烃受体核转运蛋白的类似蛋白1(Brain and muscle-ARNT-like1,BMAL1)二聚体相互作用,是能量代谢与昼夜节律间整合调控的重要分子基础。越来越多研究表明,多酚类植物化学物可参与调节外周时钟组织昼夜节律基因的表达,甚至重置外周时钟。紫檀芪(Pterostilbene,PTE)是广泛存在于葡萄等浆果中的多酚类植物化学物,具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗炎等广泛的健康效益。近年研究证实,PTE可作用于AMPK和SIRT1以发挥生物学作用。因此,我们推测PTE可以改善SR小鼠的运动耐力,其作用机制可能是通过调控昼夜节律系统与线粒体生物合成整合关键调控途径AMPK/SIRT1/PGC-1α,提高骨骼肌线粒体生物合成能力,同时调节骨骼肌核心时钟基因节律表达,进而防止SR导致的耐力下降。目的探明PTE对SR小鼠运动耐力的保护效应及其作用机制,为其应用于防治SR引起的运动耐力下降及昼夜节律紊乱提供科学依据。方法1.选用6-8周龄C57BL/6J雄性小鼠为受试动物,随机分为对照组、睡眠限制组、睡眠限制+紫檀芪低剂量(10 mg/(kg?d))组、睡眠限制+紫檀芪中剂量(50 mg/(kg?d))组、睡眠限制+紫檀芪高剂量(100 mg/(kg?d))组。采用新型睡眠剥夺仪构建SR模型,限制小鼠每日睡眠时间为4h,同时用PTE对小鼠进行灌胃干预,干预持续5天。于观察终点进行负重力竭游泳实验,比较各组小鼠的力竭游泳时间及血清运动性疲劳生化指标,评价不同剂量PTE对SR小鼠运动耐力的保护效应,并筛选最佳干预剂量。2.在成功构建SR小鼠模型的基础上研究紫檀芪100 mg/(kg?d)干预对小鼠运动耐力的保护作用机制。应用苏木素-伊红染色观察骨骼肌组织形态学变化;通过透射电镜观察骨骼肌线粒体形态结构、数量的变化。采用实时荧光PCR和免疫印迹法检测骨骼肌线粒体氧化磷酸化系统(Oxidative phosphorylation system,OXPHOS)相关基因的表达、线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mt DNA)拷贝数、线粒体生物合成相关基因的表达,评价PTE对小鼠骨骼肌线粒体生物合成能力的影响。进一步通过免疫印迹法检测AMPK、p-AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表达水平的变化,明确PTE是否通过调控AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路发挥作用。3.观察紫檀芪100 mg/(kg?d)干预对SR小鼠骨骼肌生物钟的影响及可能机制。实验分对照组、睡眠限制组、睡眠限制+紫檀芪组,于ZT0(08:00)、ZT6(14:00)、ZT12(20:00),ZT18(次日02:00)和ZT24(次日08:00)5个时间点进行取样,选用ELISA试剂盒分别检测5个时间点骨骼肌组织AMPK磷酸化酶活性、SIRT1去乙酰化酶活性;采用免疫沉淀法分别检测5个时间点骨骼肌组织PGC-1α去乙酰化水平的昼夜节律变化;采用实时荧光PCR和免疫印迹法分别检测5个时间点骨骼肌组织核心时钟基因Clock和Bmal1的mRNA及蛋白表达水平,通过余弦分析评估上述指标的昼夜节律变化,明确PTE对SR小鼠骨骼肌生物钟基因昼夜节律表达的影响。主要实验结果和结论1.SR小鼠力竭游泳时间明显缩短,运动耐力显著降低。PTE有效改善SR小鼠运动耐力,增强抗疲劳能力。SR组小鼠力竭游泳时间为7.60±1.42 min,较CON组明显缩短31.55%,血清运动性疲劳生化指标LDH、CK、BUN水平显著升高,提示SR导致小鼠运动耐力减弱,抗疲劳能力减弱。PTE干预延长SR小鼠力竭游泳时间,并不同程度减少血清中运动性疲劳指标水平,表明PTE可以提高SR小鼠的运动耐力,增强抗疲劳能力。其中100mg/(kg?d)剂量干预效果最突出,小鼠力竭游泳时间为10.71±1.40 min,较SR组明显延长40.96%,LDH、CK水平明显降低。同时,PTE干预可减轻SR诱导的小鼠体质量下降程度,并抑制血清TG、TC、HDL-C、LDL-C和FPG水平的异常变化,降低HOMA-IR,改善SR小鼠糖脂代谢异常。2.PTE明显减轻SR小鼠骨骼肌线粒体肿胀,提高SR小鼠骨骼肌线粒体生物合成能力,改善线粒体功能障碍。PTE干预明显减少SR小鼠骨骼肌中肿胀的线粒体数目,增加肌纤维间线粒体数量,提高正常线粒体的百分比,增加线粒体OXPHOS相关基因的表达、mtDNA拷贝数、以及线粒体生物合成相关基因(PGC-1α、NRF-1、ERRα和TFAM)的表达,表明PTE可明显提高SR小鼠骨骼肌线粒体生物合成能力,改善线粒体功能障碍。3.PTE可调控SR小鼠骨骼肌中AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路,显著恢复AMPK磷酸化酶活性和SIRT1去乙酰化酶活性的昼夜节律振荡。PTE干预明显升高SR小鼠骨骼肌中p-AMPK/AMPK比值,上调SIRT1和PGC-1α蛋白表达水平。同时,PTE干预显著恢复SR小鼠骨骼肌中AMPK磷酸化酶活性和SIRT1去乙酰化酶活性的昼夜节律振荡,进而调节PGC-1α去乙酰化水平的昼夜节律振荡,表明PTE可能通过调控AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路提高SR小鼠骨骼肌线粒体生物合成能力。4.PTE显著恢复SR小鼠骨骼肌中核心时钟基因Clock、Bmal1的mRNA和BMAL1蛋白表达水平的昼夜节律振荡,并调节CLOCK蛋白表达。PTE干预显著恢复SR小鼠骨骼肌中核心时钟基因clock、bmal1的m RNA和BMAL1蛋白表达水平的昼夜节律振荡。其中,SR+PTE组clock m RNA水平在ZT0、ZT6、ZT24较SR组显著增加;bmal1 mRNA水平在各时间点较SR组均无明显变化;BMAL1蛋白表达在ZT0、ZT6、ZT18、ZT24较SR组显著增加。此外,各组小鼠骨骼肌中CLOCK蛋白表达均未显示昼夜节律性振荡,SR组CLOCK蛋白表达较CON组在ZT0明显降低、ZT12明显增加;PTE干预使CLOCK蛋白表达在ZT0和ZT18明显增加,ZT12明显降低。结果表明PTE可调节骨骼肌生物钟,改善SR小鼠骨骼肌核心时钟基因表达的昼夜节律紊乱。综上所述,PTE可通过调控昼夜节律系统与线粒体生物合成整合关键调控途径AMPK/SIRT1/PGC-1α,提高骨骼肌线粒体生物合成能力,同时调节骨骼肌核心时钟基因节律表达,改善昼夜节律紊乱,进而改善SR小鼠的运动耐力。本研究旨在阐明PTE对SR小鼠运动耐力的保护效应及其作用机制,为PTE应用于防治SR导致的运动耐力下降,及特殊作业人群的保障工作提供科学实验证据。