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目的：多药耐药(multidrug resistance，MDR)是目前肿瘤化疗失败的主要原因之一，是指肿瘤细胞先天存在或经化疗药物治疗后，表现出不仅对单一化疗药物产生耐药性，而且对许多结构无关和作用机制完全不同的其他抗癌药物产生交叉耐药性。体内外研究发现肿瘤MDR机制非常复杂。其中，多药耐药基因(mdr1)及其编码产物P-糖蛋白(P-glycoprotein P-gp)的过度表达是肿瘤细胞多药耐药产生的原因之一。P-gp是依赖ATP的跨膜药物外排泵，可减少多种不同化学结构和不同作用机制的药物在细胞内的蓄积。已证实在多种实体瘤耐药细胞中有P-gp的表达，如KBV200细胞、MCF-7/Adr细胞等。研究表明P-gp的超表达主要在转录水平上进行调控。而影响mdr1基因表达调控的因素有物理因素、化学因素、癌基因、抑癌基因以及蛋白激酶类。近年来，蛋白激酶C(protein kinase C PKC)在mdr1基因表达调控机制中的作用引起了极大关注。PKC是细胞信号传导途径中的一个中心环节，调节细胞的基因表达、生长发育及分化。PKC可能通过两种机制来影响MDR表型，一种是直接磷酸化P-gp，另一种是通过磷酸化转录因子来调控mdr1基因转录。已有很多研究证实了PKC在MDR发生发展中的作用，但PKC对mdr1基因表达调控的研究国内少有报道。本课题通过对KBV200多药耐药细胞株耐药性及P-糖蛋白(P-gp)的测定，证实KBV200细胞株是P-gp高表达的稳定耐药株，以该细胞株总DNA为模板，成功构建了mdr1基因启动子绿色荧光蛋白融合表达质粒，为以后进一步研究多药耐药的机制及逆转多药耐药提供了一个重要工具。同时，初步研究了PKC调节剂对KBV200细胞PKC活性、P-gp的表达以及对mdr1基因启动子转录活性的影响。 方法:实验采用MTT法检测敏感株KB和耐药株KBV200细胞的耐药性(用Ies。表示);westem blot法检测KBVZoo及其亲本KB细胞株P一gp的表达;32P掺入法测定PKC活性;参照己公布的mdrl基因启动子序列设计引物，以KBVZoo细胞株基因组为模板，应用PCR扩增目的基因片段;通过亚克隆技术将其插入pEGFP一N:报告载体中;对克隆的DNA序列进行酶切、PCR、测序鉴定;脂质体法将质粒导入细胞:流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(green fluoreseent protein GFp)表达阳性细胞百分数。应用SPSSS.O软件包t检验或方差分析进行数据处理。 结果:长春新碱(VCR)和阿霉素(ADR)对KB细胞的ICs。值分别为ZI.84runol几和5.13nrnol/L，对KBV200细胞的IC5o值分别为1458.60nmo珑和110.37nmol几(P<0.01，与KB细胞比较)，耐药指数(Rl)分别为66.79和21.51。Westem blot结果发现p一gP在KBV200细胞中有较强表达，而KB细胞中无表达。KBVZOO细胞和KB细胞的总PKC活性分别为1.92 pmol/(min，pg)和0.89 pmol/(min·pg)(P(0.01，与KB细胞比较)，KBV20O细胞的总PKC活性是KB细胞的2.16倍。 PCR产物琼脂糖凝胶电泳可见，预期的约44ObP大小的mdrl基因启动子DNA片段条带清晰，无非特异性扩增现象。为了鉴定构建的重组质粒是否正确，我们将提取的质粒用BglH和EcoRI双酶切，电泳结果可见切出约44ObP和470Obp大小的两个条带，符合插入片段的大小。而用特异性引物进行PCR反应扩增出约440bp大小的条带，也符合预计结果。Mdrl基因启动子DNA测序结果与文献报道的完全一致。 为了观察PKC调节剂对KBV200细胞PKC活性、P一gP的表达及对 mdrl基因启动子活性的影响，将KBVZOO细胞分为3组:P琳组(200 nmol/L PMA预孵育)、SP组(100 nmol/L SP预孵育)和对照组(不加处理因素)。结果发现PMA可升高KBV200细胞的PKC总活性(尸=0.001，与对照组比较);SP可降低PKC总活性(尸=0.001，与对照组比较)。免疫印迹结果显示PMA组的P一gP表达增加，SP预孵育使p一gP的表达降低。在mdrl基因启动子绿色荧光蛋白融合表达质粒中， GFP的表达受控于mdrl启动子，因此可应用流式细胞仪计数GFP表达阳性细胞百分数，来观察PKC对mdrl基因启动子活性的影响。流式细胞仪结果发现P做预孵育后GFP表达阳性细胞百分数升高;SP预孵育后GFP表达阳性细胞百分数降低。 一2- 结论:1.KBVZOO细胞株是稳定的多药耐药株。2.与亲本株KB细胞相比，P一gP在KBv200中的表达明显增强。3.KBv200细胞经PKC促进剂或抑制剂处理后，PKC活性及P一gP的表达增强或减弱。4.成功构建了mdrl基因启动子绿色荧光蛋白融合载体，用以观察mdrl基因启动子的活性调控效应。5.PKC对mdrl基因启动子活性有增强作用。