【研究背景与目的】光感受器细胞死亡是引起视功能下降的主要原因之一。其结构上主要由富含大量线粒体的内节和富含大量膜盘的外节组成,完成生理过程所需要的能量主要来自内节的线粒体。当线粒体能量代谢出现障碍时,可导致光感受器细胞功能的紊乱,进一步导致结构的变化。有学者推测,光感受器细胞代谢失衡导致的细胞水肿可能是椭圆体结构的破坏的重要原因,在光学相干断层扫描技术（Optical Coherence Tomography）OCT表现为椭圆体带的破坏,并作为视力不良预后的标志之一。因此,深入理解线粒体代谢及功能在光感受细胞中参与发病的机制具有重要意义。本课题组基于视网膜脱离患者的玻璃体标本和视网膜下液的代谢组学结果,推测线粒体发生了能量代谢障碍。线粒体功能与线粒体形态结构密不可分,相互影响;线粒体形态的改变可能是线粒体功能损伤的早期改变。然而,线粒体形态改变导致的下游如何改变尚不清楚。本课题前期的研究发现,视网膜脱离后可导致线粒体水肿是引起光感受器细胞死亡的重要原因,至于线粒体形态如何参与调控细胞死亡的机制尚不清楚。因此,本课题主要以Drp1介导的线粒体分裂是切入点,深入研究其在光感受器细胞中参与细胞死亡的作用及相关分子机制。【方法】1.本课题组前期通过选取临床视网膜脱离患者玻璃体样本和视网膜下积液,与健康角膜捐赠眼样本进行代谢组学分析,对差异明显的代谢产物进行分析,得出与线粒体能量代谢的关系。2.动物模型的验证:以SD大鼠作为研究对象,成功建立实验性视网膜脱离的模型,并在RD 3d时利用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope）观察光感受器细胞线粒体的形态,测量线粒体的纵向直径;利用Western blotting检测视网膜脱离模型中1d,3d,5d,7d的线粒体分裂蛋白Drp1的表达,用免疫荧光标记线粒体特异性蛋白V-β抗体,观察视网膜脱离后光感受器细胞线粒体形态特征,并进行统计分析,通过one-way ANOVA方法分析各组之间线粒体直径以及Drp1的表达差异,用秩和检验方法分析各组之间的线粒体形态学比例的差异。3.建立SD大鼠实验性损伤模型,并在模型成功的同时,予以视网膜下注射Drp1特异性抑制剂Mdivi-1（2.4mg/ml）5μL作为实验组,对照组注射相应体积和浓度的DMSO（Vehicle对照组）;采取TUNEL染色,HE染色和视网膜电生理检查,评估Mdivi-1干预后视网膜感光细胞凋亡及视功能的变化;采取One-Way ANOVA统计方法分析各组差异,以P<0.05认为有统计学意义。4.为了明确Drp1抑制后参与光感受器细胞死亡的具体机制,分别进行体内和体外实验,通过成功建立SD大鼠的体内实验模型,提取实验组和对照组视网膜,并进行Western blotting蛋白检测。（1）视网膜脱离后光感受器细胞的死亡方式主要是凋亡,因此我们在凋亡高峰（RD 3 d）提取总蛋白和线粒体,利用Western blotting技术检测Mdivi-1干预后与细胞凋亡相关的蛋白和Drp1的表达;（2）为了进一步清楚引起线粒体分裂Drp1表达的上游机制,我们使用N-acetylcysteine（NAC）减少ROS,在视网膜脱离模型成功建立的同时,分别予以NAC（100μM）,（200μM）5μL进行视网膜下注射;对照组注射相应体积的生理盐水（Vehicle对照组）;利用Western blotting技术检测总蛋白和线粒体水平Drp1的表达,同时用TUNEL染色方法分析光感受器细胞的死亡情况;（3）One-Way ANOVA统计方法分析各组差异,以P<0.05认为有统计学意义。4.为了模拟体内视网膜脱离后微环境氧化应激对光感受器细胞的影响,我们采用H₂O₂ 500μM处理661w细胞进行24h培养的体外实验,分别予以Mdivi-1与si DNML处理细胞,利用细胞免疫荧光V-β抗体观察细胞线粒体形态,利用CCK8检测细胞活力,用TUNEL技术检测细胞凋亡,JC-1染色检测线粒体膜电位。One-Way ANOVA统计方法分析各组差异,以P<0.05认为有统计学意义。【结果】1.视网膜脱离患者玻璃体样本及视网膜下液代谢组学结果显示,共有8种代谢产物发生了明显的变化,其中乳酸含量较正常对照组升高,葡萄糖,丙酮酸及谷氨酰胺较对照组下降,提示线粒体三羧酸循环发生障碍,意味着线粒体的功能受损。2.透射电镜观察发现,RD中光感受器细胞的线粒体直径较正常组较短,^***P<0.0001;Western blotting蛋白表达结果发现,视网膜脱离后1天,3天,5天Drp1S⁶¹⁶/tDrp1表达较正常组升高,与正常组相比P值分别为:**P<0.01,**P<0.01,*P<0.05;对线粒体形态进行分类时发现,RD组较正常组相比,视网膜线粒体的形态主要以短状的线粒体为主,碎片化线粒体比例增加,^***P<0.0001,^***P<0.0001。推测视网膜脱离后线粒体功能障碍可导致线粒体分裂增加,这一过程可能参与了光感受器细胞的死亡。3.视网膜脱离后3天TUNEL结果显示,Mdivi-1处理组较对照组光感受器细胞死亡减少,^*P<0.001,视网膜脱离后7天,HE结果显示,Mdivi-1处理组与对照组ONL/INL比值均较正常组减少,^***P<0.001,^**P<0.001,处理组ONL/INL比值高于对照组,^**P<0.001,视网膜脱离后7天,处理组与对照组暗适应a波和b波大小较正常组均降低,^***P<0.001,^**P<0.01;Mdivi-1处理组a波,b波波幅均较对照组增大,^**P<0.01,^**P<0.01。3.体内试验Western blotting结果显示,视网膜脱离后3天Mdivi-1处理组Drp1S616/tDrp1,BAX,Caspase3较对照组均下降,^*P<0.05,^***P<0.001,^***P<0.001;线粒体提取蛋白结果显示,Mdivi-1处理组Drp1^S616/tDrp1及BAX较对照组下降,^***P<0.001,^**P<0.01;NAC处理组（100μM）,（200μM）Drp1^S616/tDrp1较对照组下降,^**P<0.01,^*P<0.05;TUNEL结果显示,NAC处理组（200μM）光感受器细胞死亡较对照组减少,^**P<0.01。4.500μM,1mM H₂O₂处理661W细胞24小时后,线粒体分裂蛋白Drp1^S616表达较正常组升高,^**P<0.01,^**P<0.01;500μM H₂O₂较正常细胞线粒体碎片化比例升高,^***P<0.001,而Mdivi-1和si DNML1线粒体碎片化比例较对照组降低;^**P<0.01,^***P<0.001;TUNEL结果显示,500μM H₂O₂处理661W细胞24小时后,细胞死亡较正常组比例升高,^***P<0.001,Mdivi-1处理组和si DNML1较对照组细胞的死亡比例减少,^***P<0.001,^***P<0.001;线粒体膜电位结果显示,500μM H₂O₂处理661W细胞24小时后,H₂O₂与CCCP处理组线粒体膜电位较正常组下降,^**P<0.01,^***P<0.001,Mdivi-1处理组较H₂O₂处理组线粒体膜电位升高,^**P<0.01。【结论】视网膜脱离后可导致光感受器细胞线粒体功能障碍和线粒体分裂增加,抑制线粒体分裂能够有效减少光感受器细胞的死亡,其中Drp1可作为一个新的神经保护靶点。