论文部分内容阅读
脓毒症(sepsis)是指严重感染导致的全身炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),宿主针对感染的特异性免疫反应失调,进而可导致脓毒性休克、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),乃至引发多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),是ICU患者的主要死亡原因,其发病率仍然很高。脓毒症急性呼吸窘迫综合征的病理生理学机制非常复杂,包括炎症激活、炎细胞浸润、凝血系统激活和肺上皮屏障损伤等,其中肺上皮是急性呼吸窘迫综合征时肺部防御损伤的一种重要结构。在ARDS的致病过程中,各种炎症因子、粘附分子、趋化因子和细胞因子等不断释放参与肺部炎症反应,如肿瘤坏死因子、IL-6、IL-8、IL-1家族和干扰素。肺上皮细胞能够分泌多种细胞因子调控肺的天然免疫,目前却没有关于肺上皮细胞表达能够调控肺部天然免疫的分泌蛋白。因此,对于肺上皮细胞在脓毒症急性呼吸窘迫综合征的基因表达及相关分泌蛋白的机制探讨值得研究,肺上皮细胞表达的分泌蛋白有望成为临床上治疗脓毒症的新的分子靶点。 sectm1b基因是一种新型人类编码基因,其基因表达的蛋白为sectm1b,即跨膜与分泌蛋白1b,属于免疫球蛋白超家族。目前sectm1b基因表达调控机制以及效应并不清楚,关于sectm1b的研究也非常少。有研究认为:sectm1b可以抑制TCR介导的T细胞活化从而发挥促炎的功能。炎症反应的失衡是脓毒症所致急性呼吸窘迫综合征的主要原因。右美托咪定作为ICU临床常用的镇静药物,最近几年,因为发现其具有抗炎的作用而逐渐被大家所关注,但目前没有关于右美托咪定对脓毒症ARDS时sectm1b表达的影响及抗炎作用的研究。另外,肺上皮细胞分泌的sectm1b能够促进中性粒细胞表达和释放促炎症因子,对中性粒细胞募集到肺部感染部位具有调控作用。但是,sectm1b对脓毒症ARDS时肺上皮细胞功能的作用及其可能的机制,目前尚未见报道。 本研究拟通过在体与离体实验,探讨肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS的影响及作用机制。首先,对脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b的筛选及验证;其次,探讨肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS促炎作用及机制;最后,探讨右美托咪定对脓毒症ARDS小鼠抗炎作用及其机制的研究,同时探讨了右美托咪定在脓毒症ARDS发挥抗炎保护作用时对肺上皮细胞sectm1b表达的影响。 第一部分 脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b的筛选及验证 目的: 脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b的基因芯片筛选与分析,在体实验和离体实验验证脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b。 方法: 1.取雄性C57小鼠,构建CLP所致脓毒症ARDS小鼠模型,分离CLP术后0h、6h、12h、24h的左肺组织,利用基因表达谱芯片检测CLP术后不同时间及正常对照小鼠肺上皮细胞基因表达差异。利用基因表达热图分析、genecard软件分析及查阅文献重点分析细胞因子与趋化因子等分泌性蛋白的表达。 2.取约8周龄雄性C57小鼠,随机分为四组,分别为:CLP术后0h、CLP术后6h、CLP术后12h、CLP术后24h。 a.取每组小鼠肺组织,左肺组织行HE染色,并进行病理学评分;右肺组织提取mRNA,采取RT-PCR技术检测sectm1b mRNA的表达情况。 b.取每组小鼠支气管肺泡灌洗液,采用ELISA法检测炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平及流式细胞术进行中性粒细胞计数。 c.于每组小鼠行眼球取血,离心后取血清,采用ELISA法检测IL-6、IL-1β、TNF-α的表达情况。 3.用LPS刺激小鼠肺上皮细胞MLE12,于LPS诱导后0h、6h、12h、24h提取mRNA,利用RT-PCR检测肺上皮细胞sectm1b mRNA的表达,同时收集上清,采用ELISA检测上清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。 结果: 1.脓毒症ARDS小鼠肺组织中基因表达差异显著,其中sectm1b在CLP术后12h表达显著增高,24h表达下降。 2. a.HE染色结果显示:CLP术后小鼠肺组织病理损伤明显加重,且术后12h损伤程度强于24h,病理学评分增高(P<0.05)。sectm1b mRNA表达差异显著(12小时大于正常约30倍)(P<0.05)。 b.ELISA结果显示:与正常对照比较,肺泡灌洗液和血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平明显升高(P<0.05)。CLP术后中性粒细胞计数明显增多(P<0.05)。 3.与正常相比,脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞sectm1b表达增高(P<0.05),上清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)。 结论: 脓毒症ARDS小鼠肺上皮细胞高表达sectm1b,脓毒症ARDS小鼠在体实验模型与离体实验模型建立成功,为后续的在体和离体实验提供了可靠的实验基础。 第二部分 肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS促炎作用及机制探讨 目的: 研究sectm1b对LPS诱导的肺上皮细胞在脓毒症ARDS炎症反应中的作用及其机制探讨。 方法: 采用siRNA转染技术沉默sectm1b基因的表达,研究在LPS诱导的肺上皮细胞MLE12在沉默sectm1b时对脓毒症ARDS炎症反应的作用及其机制。实验分为:NCsiRNA组和sectm1b siRNA组,转染48小时后,分别用LPS刺激,提取LPS刺激后不同时间点的细胞总mRNA、蛋白、上清。用RT-PCR技术检测sectm1b、IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA的表达,用ELISA技术检测IL-6、IL-1β、TNF-α水平,利用western-blot方法检测炎症相关信号通路(NF-κβ/MAPK)相关分子的表达。 结果: 1.采用siRNA转染MLE12后,LPS诱导12h后,RT-PCR显示sectm1b siRNA组sectm1b的mRNA表达水平明显低于NC-siRNA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。 2.采用siRNA转染MLE12后,LPS诱导6h、12h、24h后,sectm1b siRNA组炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平较NC siRNA组降低(P<0.05),同时ELISA结果显示sectm1b siRNA组上清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平较NCsiRNA组降低(P<0.05)。 3.采用siRNA转染MLE12后,LPS诱导12h后,与NC siRNA组相比,sectm1bsiRNA组的p65/p38/erk磷酸化表达水平下降(P<0.05)。 结论: 肺上皮细胞表达的sectm1b对脓毒症ARDS具有促炎作用,其促炎作用可能与NF-κβ/MAPK信号通路的激活有关,表明sectm1b在脓毒症肺上皮细胞的损伤具有重要作用。 第三部分 右美托咪定对脓毒症小鼠肺上皮细胞sectm1b表达的影响及保护作用研究 目的: 探讨右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)在脓毒症小鼠肺上皮细胞炎症反应中的作用及其对sectm1b表达的影响。 方法: 将C57小鼠随机分为3组:CLP组、CLP+Dex组、Sham组。给药组在小鼠CLP术前15min腹腔注射右美托咪定(50ug/Kg),CLP组小鼠在术前15min腹腔注射等体积的无菌生理盐水。收集每组CLP术后0h,6h,12h,24h的血清和肺泡灌洗液(BALF),用酶联免疫吸附试验检测血清和肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达,记录24h内小鼠的存活率。体外培养传代小鼠肺上皮细胞MLE12,分为空白对照组(未进行任何处理)、脂多糖组(LPS,1ug/ml)、脂多糖+右美托咪定组(LPS,1ug/ml+Dex,0.2ug/ml),RT-PCR检测总细胞中sectm1b mRNA的表达,酶联免疫吸附实验检测上清中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达,蛋白质印迹实验检测ERK1/2和JNK磷酸化水平。 结果: 1.与CLP组相比,右美托咪定组脓毒症小鼠血清和肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达下降,小鼠24h内的存活率上升(P<0.05)。 2.与脂多糖组相比,右美托咪定组上清中IL-6、IL-1β、TNF-α的表达减少,并且ERK1/2和JNK的磷酸化水平下降(P<0.05)。 3.与脂多糖组相比,右美托咪定组肺上皮细胞sectm1b mRNA的表达下降(P<0.05)。 结论: 右美托咪定能够影响脓毒症小鼠肺上皮细胞sectm1b的表达,同时能够减少脓毒症小鼠血清和肺泡灌洗液中炎症因子的产生,提高脓毒症小鼠24h内的存活率,对小鼠肺上皮细胞炎症反应发挥保护作用,且右美托咪定的这种作用可能与抑制ERK1/2和JNK的激活有关。