【摘 要】
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单个B细胞抗体制备技术是基于单个细胞分离技术和单细胞RT-PCR技术建立起来的一种快速制备单克隆抗体（Monoclonal antibody,m Ab）的方法,可快速获得难以制备的病原m Ab和突发传染性病病原的中和活性m Ab,单个B细胞制备抗体的核心技术之一在于单个B细胞的分离,该方法的关键是需要系统的B细胞表面标志分子m Ab。人和小鼠的B细胞表面分子m Ab研究均已十分完善,单个B细胞抗体
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单个B细胞抗体制备技术是基于单个细胞分离技术和单细胞RT-PCR技术建立起来的一种快速制备单克隆抗体（Monoclonal antibody,m Ab）的方法,可快速获得难以制备的病原m Ab和突发传染性病病原的中和活性m Ab,单个B细胞制备抗体的核心技术之一在于单个B细胞的分离,该方法的关键是需要系统的B细胞表面标志分子m Ab。人和小鼠的B细胞表面分子m Ab研究均已十分完善,单个B细胞抗体技术应用也已非常成熟,利用人CD19（Cluster of differentiation 19,CD19）、CD27（Cluster of differentiation 27,CD27）、CD38（Cluster of differentiation 38,CD38）的单克隆抗体可有效分离到单个记忆B细胞或浆细胞,但犬的免疫系统反应机制和相关免疫细胞的分类研究相对较少,更缺乏一系列犬B细胞表面标志分子的m Ab。研究发现,犬免疫系统和人免疫系统机制与特征十分相似,其CD分子与人CD分子的功能作用十分相似,因此本研究选择犬B细胞表面标志分子CD19、CD27、CD38、CD138制备其m Ab,并鉴定m Ab的生物学功能,期望为犬单个B细胞抗体制备平台实现单个B细胞的分离奠定基础。本研究主要包含以下几个方面:1、犬CD19、CD27、CD38、CD138蛋白的表达及纯化构建犬CD19、CD27、CD38、CD138重组表达质粒,分别转染Expi CHO-STM细胞和Expi293细胞进行重组蛋白表达,利用Western-blot和SDS-PAGE进行重组蛋白的鉴定,通过His亲和层析柱纯化成功获得了犬CD19、CD27、CD38和CD138重组蛋白。2、犬CD19、CD27、CD38、CD138 m Ab的制备以Expi CHO-STM细胞表达的各重组蛋白作为小鼠免疫抗原,以Expi293细胞表达的各重组蛋白作为筛选抗原,最终针对犬CD19、CD27、CD38、CD138分子分别筛选到10、3、12、2株杂交瘤细胞,各杂交瘤细胞所分泌腹水m Ab ELISA效价均不低于1:64 000。3、犬CD19、CD27、CD38、CD138 m Ab的鉴定通过细胞传代检测杂交瘤细胞稳定性,通过IFA和Western-blot鉴定m Ab特异性,通过免疫组化和流式细胞术验证各m Ab生物学功能。稳定性检测显示各杂交瘤细胞传代培养30代均可稳定分泌相应m Ab;IFA和Western-blot显示各m Ab均可特异性识别相应CD蛋白;免疫组化分析显示犬CD19和CD27分子各获一株m Ab可应用于免疫组化鉴别犬淋巴组织中表达CD19或CD27的细胞;流式细胞术检测结果显示犬CD19、CD27、CD38、CD138分子各获两株m Ab可应用于流式细胞术检测犬PBMCs中表达相关CD分子的细胞群。综上所述,本研究利用真核表达细胞成功表达并纯化了犬CD19、CD27、CD38、CD138蛋白,成功制备了四种CD分子的m Ab并对其进行系统性鉴定,为犬B细胞免疫特性研究提供了有效的抗体工具,为犬单个B细胞抗体技术平台实现单个B细胞的分离奠定了基础。
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