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目的细胞膜包括受体的转运在生命运动中起重要作用,胞内受体转运中的各个环节或通路既不是单一的,也不是均一的。针对不同的转运目标即不同的膜/膜蛋白组分,会有相应不同的接口或调控因子参与转运。EHD基因是最近发现的膜转运调控基因,虽然四个亚型(EHD1、2、3、4)在细胞中共表达,并都具有循环步的调控潜能,但它们的调控对象可能是不尽相同的,这取决于被调控对象如各类受体等本身的理化特性。新的工作显示,虽然EHD2在各种细胞中广泛表达,包括正常乳腺原代上皮细胞及其永生化衍生细胞,但却在50%以上的人乳腺癌细胞株中表达缺失,这意味着EHD2的功能及其表达调控可能与乳腺癌的发生发展有关。本课题通过DNA重组技术,构建EHD2干扰质粒,并在细胞中封闭EHD2基因蛋白表达,使其所表达的EHD2蛋白减少,观察其对细胞的生长和运动能力的影响。方法1Western Blot检测宫颈癌细胞HeLa、乳腺癌细胞MDA-MB-231、T47D和Bcap37中EHD2蛋白的表达水平。2.构建pSilencer CMV G418/EHD2质粒载体,它具有强的CMV启动子和卡那霉素抗性和新霉素抗性基因。从EHD2基因序列中选取不同的靶点,设计合成3条互补DNA序列,经退火形成双链。将双链DNA包装入质粒载体,然后转化到大肠杆菌中,经过筛选、扩增,从细菌中提取质粒并鉴定。然后将质粒转染到高表达EHD2的乳腺癌细胞中,质粒在细胞内转录,生成发卡RNA,并通过小RNA干扰原理抑制EHD2蛋白表达。3.筛选转染成功的细胞,有限稀释法获得EHD2蛋白表达下降的克隆。4.MTT法观察细胞的生长状况。5.划痕实验检测细胞的非定向运动能力和趋化实验检测细胞的趋化运动能力。结果1.EHD2在乳腺癌细胞T47D和Bcap37中表达较高,在宫颈癌细胞HeLa也有较高的表达。2.成功构建pSilencer CMV G418/EHD2质粒载体,并利用HeLa细胞为模型,通过筛选验证,确定最有效的干扰质粒载体,将其命名为siEHD2-46。3.将纯化的质粒siEHD2-46通过脂质体介导的方式转染T47D和Bcap37三种细胞,分别利用有限稀释法筛选得到有效克隆。4.降低EHD2蛋白的表达水平可以减少总的EGFR表达水平。5.细胞增殖实验结果显示：siEHD2组细胞生长明显快于质粒对照组N,差别有统计学意义(P<0.05)。6.划痕结果显示：siEHD2组移动慢于质粒对照组N,差别有统计学意义(P<0.05)。趋化运动的检测结果显示：siEHD2组细胞受EGF的趋化能力明显低于质粒对照组细胞,且差别有统计学意义(P<0.05)。结论EHD2蛋白表达水平的降低促进了乳腺癌细胞系的增殖,并明显抑制了细胞的迁移。EHD2可能通过调节细胞生长及/或趋化因子受体影响乳腺癌的发生与发展,因此可能成为乳腺癌分子靶向治疗的新途径。