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目的:心肌缺血再灌注损伤(Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury,MIRI)即心肌缺血后重新恢复血液供应而引起的过氧化损伤,其主要病理特点为心肌细胞凋亡、坏死,心肌功能障碍和结构损伤,导致心律失常、心梗面积加大、心脏衰竭等临床现象的发生。二氢槲皮素(Dihydroquercetin,DHQ)作为一种二氢黄酮醇类化合物,具有广泛的生物活性,包括抗炎、抗氧化、保护心血管、抗菌、抗病毒等作用。DHQ在抗缺血再灌注损伤具有良好的作用,但其相关分子机制尚未明确,因此本课题拟对DHQ抗MIRI的保护作用及潜在作用靶点进行深入研究,以揭示DHQ抗心肌损伤可能的分子机制,为DHQ的临床应用提供理论依据。方法:1.DHQ对H/R诱导的H9c2心肌细胞的保护作用与分子机制研究首先建立H/R心肌细胞损伤模型,采用噻唑蓝MTT法确定DHQ的最佳给药浓度,以用于后续实验。然后使用相关试剂盒检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活力、细胞内过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)含量;采用流式细胞仪检测活性氧(ROS)水平;通过JC-1染色观察分析线粒体膜电位变化。最后使用Western blot检测心肌细胞中PI3K/AKT信号通路蛋白中p-PI3K、p-AKT、凋亡蛋白Bcl-2家族Bcl-2与Bax的比例及内质网应激信号通路相关蛋白p-PERK、p-eif2α、IRE1α、ATF6、GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12 的表达水平。2.DHQ对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及分子机制研究采用Langendorff离体心脏灌流技术,模拟心肌缺血再灌注损伤模型,记录并分析DHQ对离体心脏收缩功能参数心率、LVSP、+dP/dtmax以及-dP/dtmax的影响;检测组织心肌酶CK、AST的活力和抗氧化酶T-AOC,SOD,GSH-Px,CAT活性以及ROS水平和MDA的含量;通过HE染色法观察大鼠心肌组织病理学的改变。应用Western blot检测上述蛋白表达水平。结果:1.DHQ对H/R诱导的H9c2心肌细胞的保护作用与机制研究通过MTT法确定不同浓度DHQ对H9c2心肌细胞增值无显著影响;在DHQ给药浓度为20 μM时,明显抑制H/R诱导的心肌细胞损伤,并且作用效果最好。DHQ预处理可显著抑制H/R诱导的H9c2心肌细胞LDH的释放及MDA水平的升高并提高三种抗氧化酶(SOD、CAT和GSH-Px)的活性,降低细胞内ROS水平,抑制H/R诱导的心肌细胞损伤,提高红/绿荧光比值。Western blot结果表明DHQ预处理可上调p-AKT、p-PI3K蛋白的表达,提高Bcl-2/Bax 比例,下调 p-PERK、p-eif2α、IRE1α、ATF6、GRP78、CHOP、p-JNK、Caspase-12的表达水平。2.DHQ对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究在I/R模型上,分析DHQ对离体心脏收缩功能参数的影响,与I/R组相比,预给药20μM的DHQ可以显著提高LVSP、±dP/dtmax,并调节心率。而PI3K抑制剂LY294002能够抑制DHQ对心脏收缩功能的改善作用。分析心肌酶、抗氧化活性发现DHQ预处理组能够显著抑制CK和AST的释放,增强T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px的活性,同时也能降低ROS和MDA的水平,而LY294002能够明显反转DHQ的作用效果。组织病理学结果表明DHQ预处理能够显著改善心肌细胞的变性,减少心肌纤维断裂,增宽间质,减少胞膜破裂,缓解胞质溶解现象等的病理特征,可见变性坏死的心肌纤维显著减少,心肌细胞的间质较窄,心肌细胞排列较为整齐紧密。在给予LY294002后,明显抑制上述改善的情况。Western blot结果表明DHQ预处理后可上调p-AKT、p-PI3K蛋白表达水平,提高Bcl-2/Bax比例,抑制内质网应激信号通路相关蛋白GRP78、p-eif2α、p-PERK、IRE1α、ATF6、CHOP、p-JNK、Caspase-12 的表达水平,而给予 LY294002 后,DHQ 对上述蛋白的调节作用不明显。结论:DHQ可通过激活PI3K/AKT通路抑制氧化应激和内质网应激反应,阻止细胞凋亡的发生,从而对心肌缺血再灌注损伤起到保护作用。本研究为DHQ的临床应用提供理论依据。