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猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种急性、高致病性肠道传染病,主要危害哺乳仔猪。临床表现为水样腹泻,呕吐脱水等症状。哺乳仔猪通过乳汁中的母源抗体(分泌性IgA)获得被动免疫保护是较为有效的预防方式,检测乳汁中的抗体对于防控PED具有重要意义。本研究从临床检测病料中分离到一株PEDV并进行鉴定;在HEK-293悬浮细胞中表达了该毒株的N蛋白,以其为抗原分别建立了检测PEDV血清IgG及乳汁IgA抗体的间接ELISA检测方法,为PEDV的预防提供支持。相关研究结果如下:1.PEDV-JX18毒株的分离与鉴定2018年江西省某猪场送检疑似感染PEDV的小肠组织,剪碎研磨并用细胞培养基过夜浸泡研磨组织获得病毒液,通过Vero细胞进行病毒分离,在Vero细胞上盲传至第五代时观察到细胞病变,经RT-PCR,IFA,透射电镜及细胞超薄切片等方法鉴定,确定分离出一株田间的猪流行性腹泻病毒,并命名为PEDV-JX18株。2.PEDV血清IgG间接ELISA方法的建立将PEDV-JX18株N基因克隆到pcDNA3.4(+)质粒上,瞬时转染悬浮培养的HEK-293细胞并纯化获得N蛋白,作为研制PEDV血清IgG抗体的间接ELISA方法的包被抗原。优化各组分的剂量及孵育时间确定最佳反应条件,抗原包被量为2mg/mL,最佳血清稀释度为1:80,孵育时间为37℃30 min,山羊抗猪IgG-HRP稀释浓度为1:4000,孵育时间为37℃,1.5 h,TMB显色时间为37℃,15 min。使用40份PEDV阳性血清及178份阴性血清样品对间接ELISA方法进行评价,运用SPSS 17.0软件绘制ROC曲线对结果判定,确定临界值为0.585,敏感性为100%,特异性为96.7%。重复性试验结果表明其变异系数均小于10%,说明建立的用于检测PEDV血清IgG的间接ELISA方法具有良好的稳定性及可重复性。3.PEDV乳汁IgA间接ELISA方法的建立以HEK-293细胞表达的重组PEDV N蛋白作为包被抗原,建立检测PEDV乳汁中IgA抗体的间接ELISA方法。优化各组分的剂量及孵育时间确定最佳反应条件,最佳抗原包被量为1mg/mL,最佳乳汁稀释倍数为1:2,乳汁孵育时间为37℃,30 min,山羊抗猪IgA-HRP稀释浓度为1:2000,孵育时间为37℃,1 h,TMB显色时间为37℃,10 min。选取实验室保存的31份乳汁阳性样品及25份阴性乳汁样品运用SPSS 17.0软件绘制ROC曲线,确定临界值为0.653,敏感性为100%,特异性为96%。重复性试验结果表明其变异系数均小于10%,说明建立的检测PEDV乳汁IgA间接ELISA方法具有良好的稳定性及可重复性。本研究成功分离到一株PEDV田间毒株,命名为PEDV-JX18株;在HEK-293细胞中成功表达N蛋白,并以此作为包被抗原,分别建立检测血清中PEDV IgG抗体和乳汁中IgA的间接ELISA方法,为PEDV临床预防提供技术支持。