研究背景:肺癌是危害人类生命健康最严重的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率极高,据资料显示,2010年美国肺癌新发病220,000例,死亡160,000例。在我国,肺癌发病率早已位居全部恶性肿瘤之首,为男性恶性肿瘤第一位,女性恶性肿瘤第二位。近几十年来,肺癌发病率和死亡率逐年上升,已严重威胁我国乃至全球居民的生命健康。21世纪以来,由于人类基因组计划的实施,国内外对肺癌发病病因的认识已摆脱传统流行病学研究所探讨的环境因素引起肺癌,认为肺癌是环境因素与个体遗传因素相互作用的结果,且个体遗传因素起着主要作用。如多个研究都报道了人类染色体13q23区尼古丁受体基因家族与吸烟致肺癌密切相关,DNA双链断裂修复酶(NBS1、RAD51等)的基因遗传变异能影响个体对环境因素所致DNA损伤的修复,从而与肺癌易感有关。基因的遗传变异,例如广泛存在于人类基因组的单核苷酸多态性,可以通过影响基因的表达、结构而影响基因的功能,在环境致癌物作用下,发挥不同的效应,从而导致个体对肺癌易感。肿瘤干细胞研究是肿瘤研究的一个新热点。自Disk等首次从人急性髓样白血病中分离出白血病肿瘤干细胞,证实了肿瘤干细胞的存在后,大量的研究发现并证实在乳腺癌、肺癌、黑色素瘤及其他系统中皆存在类似的肿瘤干细胞,从而为肿瘤干细胞学说提供了坚实的证据。2006年,美国癌症协会(American Association for Cancer Research)将肿瘤干细胞定义为:肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。肿瘤干细胞与干细胞一样具有无限增殖能力,一旦突变获得过度增殖能力,就可以转化成为肿瘤。大量研究表明肿瘤干细胞在肿瘤组织中数量稀少,但具备自我更新、增殖和分化潜能,在肿瘤的发生、发展、复发和转移中起着重要作用。肿瘤干细胞是肿瘤发生的源泉,研究其发生机制将有助于阐述癌症的发病机制并为癌症治疗提供科学依据。与正常干细胞相似,外界因子通过体内特定的信号通路途径来调控肿瘤干细胞的功能。目前,已被证实的与肿瘤干细胞密切相关的细胞信号通路有Notch、Wnt/β-catenin、Hedgehog信号通路。Musashi1 (MSI1)是最新研究报道的肿瘤干细胞标志物之一,研究表明其在Notch、Wnt/β-catenin、Hedgehog等信号通路中发挥着最重要作用,与肿瘤干细胞的发生、发展密切相关。MSI1是一种RNA结合蛋白,可调控多个肿瘤相关基因的表达。MSI1能够在多个层面上决定细胞命运,如维持干细胞的状态、细胞的分化和肿瘤的发生等。Wang等发现MSI1基因在乳腺癌组织中高表达,过度表达的MSI1能促进乳腺肿瘤细胞的增殖,诱导肿瘤转移以及导致肿瘤细胞耐药,最终影响肿瘤预后。位于基因启动子区的单核苷酸多态(SNP)可影响转录因子的结合能力而影响基因的表达,从而与肿瘤发病相关。基于Genbank的单核苷多态性数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的生物信息学分析发现,MSI1基因启动子区仅存在两个常见多态位点(最小等位基因频率>5%), -2696 T>C(rs7959801)和-2297 T>C(rs3742038),功能分析(http://snpinfo.niehs.nih.gov/)显示上述两位点皆是潜在的功能性位点。进一步进行连锁不平衡分析发现两个位点不存在连锁关系(D’=0.256, r2=0.002)。因此,本课题拟通过大样本肺癌病例与对照研究,检测MSI1基因启动子多态-2696 T>C(rs7959801)和-2297 T>C(rs3742038)在肺癌病例对照中的基因型频率,分析MSI1基因启动子区多态与人群肺癌发病的关联,并通过体外构建报告基因载体,进一步对关联实验结果进行功能验证,以阐述MSI1基因启动子区多态与我国南方人群肺癌发病的关联。研究目的:研究MSI1基因启动子区多态与我国南方人群肺癌发病的关联,并分析基因与环境暴露因素的交互作用在肺癌发病中的作用,进一步通过生物学功能实验阐述该基因变异与肺癌发病关联的分子生物学实质,为肺癌的预防、诊断、治疗提供科学依据。研究方法:采用病例-对照的研究方法,于2007年3月～2009年3月收集广州市区及周边共六所医院新诊断的经病理证实的原发性肺癌病例1056例,按性别1:1、年龄±1岁频率配比原则于同期参加社区健康体检项目10000名体检者中随即选取1056例正常健康人为对照;采用Taqman基因分型技术检测MSI1基因启动子单核苷酸多态位点-2696 T>C(rs7959801)和-2297 T>C(rs3742038)的基因型,其中针对不同等位基因设计两条探针并于5’端分别标记FAM基团(蓝色)和VIC基团(红色),3’端标记淬灭荧光MGB基团,在ABI7500基因分型模块系统上,根据不同颜色荧光值进行基因分型;为验证基因型判断的准确性,分别从肺癌病例和健康对照中选取30对样本进行PCR扩增,进行测序验证;采用SAS 9.13软件进行χ2检验以分析性别、年龄、吸烟、饮酒、家族肿瘤史、BMI、等位基因及基因型频率在病例组和对照组间的差异,并进行Hardy—Weinberg平衡检验,比较对照组人群实际基因型频率与预期基因型频率吻合程度,判断结果是否符合人群分布标准,采用多因素非条件Logistic回归分析-2696 T>C(rs7959801)和-2297 T>C(rs3742038)多态与人群发生肺癌的危险性关联,计算变异等位基因(allele)的个数和肺癌发病风险的剂量-效应关系;所有检验均为双侧检验,检验水准为α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。采用体外载体构建与报告基因检测技术分析关联实验结果的功能机制:PCR扩增含MSI1基因启动子区域2950bp片段(相对于翻译起始位点+36bp～-2914bp)后,将PCR产物连接到PGL3-basic载体,酶切、测序鉴定。针对人群研究所筛选的关联变异位点,应用定点突变技术,构建体系含不同等位基因的荧光素报告基因质粒。将构建的荧光素酶报告质粒分别转染A549(人肺腺癌细胞株)和NCI520(人肺鳞癌细胞株)2种人肺癌细胞株,在生物发光检测仪上检测不同质粒的荧光素酶活性水平,以pGL3-basic质粒作为阴性对照,海肾萤光素酶质粒(pRL-TK)作为内参,检测Luciferase活性水平。采用t检验分析体外萤光素酶报告基因实验的结果。研究结果:1.1人口学基本特征及单因素分析共收集肺癌病例1056例,并相应配比收集对照1056例。其中,病例按临床分期有I期154例,II期94例,III期333例,IV期475例;按病理类型分类有腺癌384例,鳞癌369例,大细胞肺癌43例,小细胞肺癌128例,混合型或未分化癌132例;性别、年龄在病例与对照间无显著差异(P年龄=1.000,P性别=0.931)。经单因素分析发现,吸烟、体重指数在病例对照见分布差异具有统计学意义(P吸烟=0.028,PBMI<0.001),表明吸烟、体重过高是我国南方人群肺癌发病的危险因素。此外,癌症家族史、肺癌家族史、饮酒在病例对照间均无显著差异,可能与我国南方人群肺癌发病无关(P癌症家族史=0.942,P肺癌家族史=0.150,P饮酒=0.916)。1.2 MSI1启动子多态与肺癌发病关联分析-2696 T>C(rs7959801)多态基因型在病例对照间频率分布如下:病例组TT、CT、CC频率依次为53.3%、36.5%、10.1%,对照组则依次为43.5%、46.6%、9.9%;-2696 T>C基因型在对照人群中的频率符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.096)。MSI1基因-2696 T>C基因型在肺癌对照中的分布差异有统计学意义(P=7.89×10-6)。以-2696 TT野生基因型个体为参照,CT基因型携带者发生肺癌的危险性较TT基因型者显著降低(adjusted OR=0.64; 95%CI=0.52-0.78, P=1.3×10-6); CC基因型携带者发生肺癌的危险性亦降低(adjusted OR =0.87;95%CI=0.62-1.21)但因其频率在病例对照间太低,该效应无统计学意义(P=0.276);将变异C基因型(CT+CC)进行合并做二分类处理,发现以-2696 TT基因型的个体为参照,携带C变异基因型者患肺癌的危险性显著下降(adjusted OR=0.81;95%CI=0.70–0.94,p=7.3×10-6)。肺癌的发病风险与-2696 C等位基因个数有显著的剂量效应关系(Ptrend=0.0042)。进一步分层分析发现,在无家族癌症遗传史者(adjusted OR=0.65; 95%CI=0.54-0.78, p<.0001)、BMI值18kg/m2- 25 kg/m2组者(adjusted OR=0.67; 95%CI=0.55-0.83, p=0.0001)和>25 kg/m2 (adjusted OR=0.56; 95%CI=0.35-0.88, p=0.0134)组者中携带-2696C变异基因型的个体发生肺癌的危险性下降得更为显著。-2297 T>C(rs3742038)基因型CC、CT、TT在病例和对照中的频率分别为90.9%、8.24%、0.85%和88.5%、10.8%、0.66%,其基因型频率在对照人群中的频率符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.092)。但两组人群-2297 T>C基因型的分布差异无统计学意义(P=0.1220),进一步的分层分析亦未发现各亚组中-2297 T>C基因型在病例与对照间有显著的差异。1.3 MSI1启动子荧光素酶活性检测(luciferase)关联研究发现-2696 T>C多态位点与肺癌发病相关,因此我们通过体外克隆技术结合定点诱变,分别成功构建含-2696 T等位基因和-2696 C等位基因的荧光素酶表达载体(p-2696T和p-2696C)。载体分别瞬时转染人肺癌细胞株A549和NCI-520后,进行荧光素酶活性检测。结果显示在A549和NCI-520中含p-2696C载体Luciferase活性皆显著低于p-2696T载体Luciferase活性(P值分别为0.0006,0.0021),表明在肺癌细胞株内,-2696 C变异等位基因能显著降低MSI1基因启动子转录活性,从而可能降低MSI1基因的表达,这与关联实验结果是一致的。本研究创新之处本课题第一次从SNP角度研究干细胞标志物Musashi1与我国南方人群肺癌危险性的关系,首次发现了Musashi1基因启动子区域-2696 T>C位点与我国南方人群肺癌发病有关,填补了国内外相关研究的空白。本研究的不足之处本研究缺乏在肺癌组织中检测Musashi1基因型与其蛋白表达水平(表型)的关联研究(Western Blot),及进一步通过EMSA试验分析-2696T>C位点的遗传变异与核内转录因子结合能力的差异,以证实上述变异肺癌发病的分子生物学实质。研究结论:Musashi1基因启动子-2696C变异基因型可降低中国南方人群患肺癌的危险性,尤其在无家族癌症遗传史、BMI值在18-25kg/m2和>25kg/m2组中更为显著,进一步的功能实验证实-2696C变异等位基因可降低MSI1基因启动子的转录活性。进而可能影响基因的表达,从而与肺癌发病相关。