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核酸酶是一类以核酸为底物,催化磷酸二酯键水解的一类酶。核酸酶广泛存在于微生物与动植物中,参与DNA的复制、重组及修复等重要的生理活动。本实验从湖北宜昌江水中分离得到一株微小杆菌,并将其命名为yc3。研究发现,该菌株能分泌一种耐热DNA酶。通过硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子交换层析和阳离子交换层析等蛋白纯化方法,本研究从微小杆菌yc3的菌液上清中分离得到一种分子量约为20 kDa且具有耐高温DNA酶活性的蛋白。研究发现,该DNA酶的最适反应pH范围为6-9;最适反应温度为28℃-37℃,在90℃处理10分钟后仍然具有明显的DNA酶活性。质谱测定结果显示,20 kDa蛋白与来源于微小杆菌255-15的一种分泌蛋白的同源性较高。通过分析该分泌蛋白的同源蛋白以及它们对应的DNA序列,本研究设计了简并引物,扩增出了编码20 kDa蛋白的基因。序列分析显示,这个20 kDa蛋白蛋白属于HNH内切核酸酶超家族。因此本研究将该20kDa蛋白命名为EheA(Exiguobacterium HNH Endonuclease).本研究还利用麦芽糖结合蛋白(MBP),成功地在大肠杆菌中表达了 MBP-EheA的融合蛋白,并通过在MBP-EheA融合蛋白中引入Tev蛋白酶酶切位点,纯化获得了较高纯度的重组EheA蛋白。重组EheA蛋白的酶学特性研究显示重组EheA具有耐热的DNA酶活性,其生化特性与从菌液上清中分离的野生型EheA的生化特性吻合。因此,综上所述,本研究分离纯化到的EheA的确是一种耐热DNA酶。通过序列比较,本研究还发现EheA的H 116、N141和N156在所有同源性高于300%的同源蛋白中均保守。我们随后构建了 EheA的突变体H116A、N141A和N156A,研究显示,以上三个突变体均基本丧失DNA酶活性,因此H116、N141和N156对EheA的DNA酶活性起重要作用。由于HNH超家族的第二个亚家族的HNH模体中用于结合金属离子的组氨酸(H)被天冬酰胺(N)替代,形成HNN模体,因此我们推测EheA属于HNH内切核酸酶超家族中的第二个亚家族。此外,我们还发现EheA的H64对于DNA酶的活性也非常重要,但该氨基酸残基的具体功能有待研究。生物信息学研究还发现ehAd的基因序列在微小杆菌属细菌的基因组中广泛及保守地存在,而且EheA的同源蛋白可以分为两大类,这种分类与微小杆菌16S rDNA及PFGE I-CeuI限制性酶切图谱的分类相一致,这说明EheA可能在微小杆菌中起重要作用并与进化相关。