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研究背景：胃癌(gastric cancer, GC)是目前世界上发病率第四位的肿瘤,居消化道恶性肿瘤发病率及病死率之首。全世界每年有750000患者死于胃癌,我国每年有16万人死于胃癌。迄今为止,胃癌的发病机制仍然不清楚。在胃癌的防治中胃癌早期诊断、复发转移预测和预后评估具有重要作用。寻找新的肿瘤标志物及基因治疗靶点成为当务之急。RKIP是一种高度保守、广泛表达、具有多种生理与病理功能的小分子胞浆蛋白。RKIP又名PEBP1(磷脂酰乙醇胺结合蛋白1),近期研究[3-6]发现其表达下调或缺失在多种肿瘤发生发展中具有重要的作用,因此RKIP在恶性肿瘤中的作用机制已经成为肿瘤领域个新的研究热点。我们前期研究发现Raf激酶抑制蛋白(Rafkinase inhibitor protein)即RKIP在胃癌中存在表达下调或缺失,其表达改变可能与胃癌的发生、分化、浸润及转移有关,但是RKIP在胃癌发生和转移中的作用及其机制国内外均未见报道。有研究认为细胞中绝大多数酶的功能和调控过程是由蛋白质复合体或蛋白质网络协同作用实现的。因此我们在前期研究的基础上,应用亲和纯化耦联质谱为主的靶向蛋白质组学技术分离、鉴定胃癌细胞SGC7901中RKIP相互作用蛋白,以探讨RKIP抑制胃癌的发生发展的分子机理,为胃癌的早期诊断、预后监测及靶向基因治疗提供依据和新的线索。第一章pCDNA3.1-PEBP1-3xFLAG表达载体构建目的：构建3xFLAG标记的PEBP1(即RKIP)融合蛋白表达载体。方法：(1)根据Sigma公司的p3xFLAG-CMV-14载体上对应序列合成3xFLAG;(2)PCR扩增PEBP1CDS区,同时引入3xFLAG标签；(3)用HindⅢ和XhoⅠ将PEBP1-3xFLAG的PCR片段及目的载体pCDNA3.1(+)双酶切,然后进行连接。酶切、测序等鉴定重组质粒；(4)测序正确的质粒转化至感受态大肠杆菌,扩增并大量提取质粒。结果：(1)成功合成3xFLAG序列；(2)将3xFLAG标签序列引入PEBP1基因序列C端,双酶切鉴定克隆正确；(3)将联合基因片段连接至pCDNA3.1载体,并测序证实基因片段序列完全正确。结论：成功构建融合基因载体pCDNA3.1-PEBP1-3xFLAG。第二章RKIP相互作用蛋白的筛选目的：分离、鉴定胃癌SGC7901细胞中RKIP相互作用蛋白,验证RKIP与HSP90、keratin、14-3-3的相互作用。初步研究RKIP抑制胃癌的发生发展的分子机理,为胃癌的早期诊断、预后监测以及靶向基因治疗提供依据和新的线索。方法：(1)通过脂质体介导将pcDNA3.1-RKIP-3xFLAG融合表达载体瞬时转染至SGC7901细胞,RT-PCR和Western blotting分别检测转染细胞中RKIP mRNA和蛋白表达水平；(2)利用3xFLAG标签的亲和层析技术提纯RKIP蛋白复合体；1D-SDS-PAGE技术预分离蛋白复合体；(3)ESI-Q-TOF串联质谱分析鉴定RKIP目互作用蛋白质；(4)数据库查询及蛋白质GO功能聚类分析。(5)大量收集SGC7901细胞,提取总蛋白；(6)RKIP抗体及非免疫IgY抗体免疫共沉淀相关蛋白；(7)应用HSP90、keratin或14-3-3蛋白抗体检测相关蛋白表达。结果：(1)成功转染融合表达载体至SGC7901细胞,在RKIP转染细胞中通过RT-PCR及WB检测到RKIP表达明显上调；(2)成功纯化并分离RKIP-3xFLAG融合蛋白复合物；(3)共鉴定出RKIP相互作用蛋白72个,功能分类包括蛋白质代谢酶类、分子伴侣、生物氧化相关酶类,细胞骨架蛋白、信号转导相关蛋白,酶解相关蛋白和一些功能未知蛋白等。(4)根据人类GO slim vl.8软件对72个与RKIP相关的蛋白质进行分析,按照生物过程分类,其中参与细胞生长增殖、凋亡过程的占30%,其次为参与生理调节以及与其他细胞及组织发生相互作用的的蛋白；按照细胞成份的注释,鉴定出蛋白中大多数属细胞内蛋白(90%),其中27%属于胞浆蛋白,16%属于细胞核蛋白,12%属于细胞质膜蛋白；按照分子功能的注释,49%的蛋白属于binding蛋白,参与信号转导和转录调节的蛋白分别占3%、1%,25%具有催化活性,其中10%的蛋白具有分子结构调节活性,7%具有酶调节活性。(5)应用免疫共沉淀联合Westerning Blotting在RKIP免疫复合物检测到HSP90、14-3-3、Keratin蛋白的表达。结论：成功鉴定出72个RKIP相互作用蛋白质,其中包括HSP90、keratin、14-3-3、GSTP1、Filamin、tubulin、弹性蛋白(Vimentin)、Annexin A1等,并首次鉴定、验证出HSP90、14-3-3、Keratin蛋白与RKIP存在相互作用。这些蛋白被认为在胃癌的发生发展或在调节胃癌细胞的侵袭和转移过程中可能发挥重要作用,推测RKIP可能通过与它们的相互作用对胃癌的发生发展及转移起作用。