研究背景:胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,根据世界卫生做只的最新报道,胃癌的发病率居恶性肿瘤全球发病率的第5位,其病死率更是高居第3位,仅次于肺癌与肝癌,赫捷教授报道的我国最新的癌症发病率和病死率显示,中国每年胃癌新发病例数达40万例,占世界新发病例数的42%,死亡人数约30万。胃癌仍然是危害我国人民健康的重大疾病。与欧美国家较低的发病率和日韩国家较高的早期胃癌诊断率相比,我国仍然面临十分严峻的抗击胃癌形势。目前针对胃癌的治疗,临床上主要以手术切除结合化学治疗和放射治疗的手段为主,常用的化疗药物有胸苷酸合成酶抑制剂(5-FU),另外有紫杉醇、顺铂等以及他们的联合应用,手术治疗、化学治疗及放射治疗都会给患者带来很多的痛苦,长期还会带来不可想象的毒副作用。因此找到一种无毒副作用的药物及并揭示其作用靶点,对于胃癌的临床治疗、改善患者预后及提高患者生存质量具有非常重要的临床意义。白藜芦醇是一种天然多酚类化合物,广泛存在于葡萄、花生、虎杖、桑葚及白藜芦等多种植物和食物中,大量研究表明白藜芦醇具有抗炎、抗氧化、抗心血管、延缓衰老、抗肿瘤等多方面的药理作用。因此作为一种抗肿瘤药物白藜芦醇具有非常重要且独特的药用价值。蛋白质组学在肿瘤研究中应用广泛,蛋白质组学技术在胃癌的治疗方面的应用目前主要集中于抗胃癌药物作用靶点的发现和某些抗癌药物药理作用机制的研究。众多研究证明蛋白质组学的应用既有利于揭示生命活动的规律也有助于推动肿瘤病人个体化的靶向治疗,具有广阔的发展前景。前期白藜芦醇对胃癌作用的大量研究,主要集中在对胃癌细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响以及对胃癌细胞的迁移和侵袭机制等方面的研究,有关白藜芦醇对胃癌敏感性差异的研究及白藜芦醇对胃癌细胞蛋白质组作用的研究未见报道。因此从蛋白质组学角度,探讨白藜芦醇对其胃癌蛋白质组的影响,继续寻找新的有效的药物作用靶点对胃癌的治疗十分必要。目的:本研究旨在(1)探究白藜芦醇对不同敏感性的人胃癌细胞系蛋白质组的影响;(2)探讨白藜芦醇可能的作用机制及细胞系产生敏感性差异的可能原因;(3)寻找可能存在的抗肿瘤作用靶点,为深入开展本领域研究、实现药物临床转化及肿瘤个体化治疗提供依据。方法:(1)细胞系筛选和药物处理:选取对白藜芦醇不同敏感性的人胃癌细胞系BGC-823和AGS,分别于含有10%国产胎牛血清、1%抗生素(青霉素和链霉素)的低糖DMEM和HAM’S/F12培养基中培养,药物处理组用100μM白藜芦醇处理细胞48h,收集细胞和细胞爬片。(2)蛋白质组学:对白藜芦醇处理前后的细胞提取蛋白质,进行双向凝胶电泳,选取差异蛋白点用质谱技术进行鉴定分析,选取潜在的抗肿瘤靶点。(3)利用Real-time PCR、ICC和Western-blotting等方法检测白藜芦醇处理前后细胞系BGC-823和AGS细胞中CK18和E-cadherin的表达情况。利用IHC检测CK18和E-cadherin在胃组织阵列中的表达情况并进行相关性分析。结果:(1)双向电泳和质谱分析结果显示,白藜芦醇处理BGC-823和AGS细胞后,CK18表达升高,AGS细胞经100μM白藜芦醇处理48h后CK18呈7.6倍上调。(2)质谱鉴定结果显示蛋白质主要集中在细胞骨架、细胞间黏附、信号通路相关蛋白、转录调节相关蛋白及代谢相关蛋白。AGS主要富集在中间纤维,823主要集中在细胞周期的调节。(3)ICC检测100μM白藜芦醇处理胃癌细胞系BGC-823、AGS中CK18的表达均上调,在AGS中表达上调更明显。在胃癌细胞系BGC-823、AGS中白藜芦醇处理48h后E-cadherin的表达上调,在AGS中表达上调更明显。Real-time PCR结果显示,100μM白藜芦醇处理人胃癌细胞系BGC-823、AGS后,CK18在BGC-823中表达上调,在AGS中表达稍微下调;E-cadherin在BGC-823中表达上调,在AGS中表达下调。Western-bloting结果显示,100μM白藜芦醇处理细胞48h后,BGC-823、AGS细胞系中CK18表达上调,且AGS中上调更明显。E-cadherin没有出现目的条带。IHC结果显示:CK18和E-cadherin在胃组织膜上和浆中的表达均有统计学差异,且与胃组织的分型有相关性,CK18和E-cadherin在胃组织膜上的表达相关性分析,二者表达呈正相关且统计学分析有显著差异。结论:(1)敏感性不同的两个细胞系白藜芦醇处理之后,变化趋势一致的只有8%(3/42),说明白藜芦醇对敏感不敏感细胞系蛋白表达的影响是不同的。(2)从目前的蛋白质分析结果来看,蛋白质主要集中在细胞骨架、细胞间黏附、信号通路、转录调节及代谢等相关蛋白,提示白藜芦醇抗肿瘤生物学作用具有多向性和多靶点特征。但AGS的上调蛋白主要富集在中间纤维,823主要集中在细胞周期的调节。(3)人胃癌细胞系BGC-823及AGS经100μM白藜芦醇处理后上皮性标志物CK18及E‐cadherin表达上调,且在AGS中表达上调明显,提示与白藜芦醇敏感性相关。(4)CK18及E‐cadherin在胃组织阵列膜上表达呈显著正相关,在低分化癌变组织中CK18和E‐cadherin在膜上表达的阴性表达率显著升高,且随着癌变程度的升高,阴性表达率升高。提示二者在膜上表达的降低与肿瘤的发生发展密切相关。(5)低分化胃癌细胞系BGC-823及AGS,白藜芦醇处理后CK18和E-cadherin表达上调,提示白藜芦醇可能有诱导胃癌间质向上皮转化的作用,而CK18可能为白藜芦醇作用于胃癌的抗肿瘤作用靶点。