目的:　　本研究中将进一步验证miR-145能否调控CTNND1的表达及其定位，研究CTNND1与cadherin家族成员的作用关系，并深入探讨其调控的分子机制。此外，我们还将构建裸鼠成瘤模型，在体内进一步验证CTNND1的表达及定位与胃癌浸润的关系。　　方法:　　1.本研究对126例临床胃癌标本和50例非肿瘤胃黏膜组织进行免疫组化方法检测CTNND1的表达和观察其细胞定位情况，并进一步分析其表达和定位与临床病理参数的关系。　　2.利用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线，采用Log-rank检验对两组胃癌患者（阴性与阳性，膜定位与浆定位）的总体生存率和无瘤生存率进行统计分析，探讨CTNND1的表达及其定位与胃癌患者生存率的关系。　　3.通过Cox比例风险回归模型单因素和多因素统计分析，进一步验证CTNND1浆定位能否作为预测胃癌患者预后的独立危险因素。　　4.构建CTNND1过表达和siRNA质粒，将CTNND1 cDNA和CTNND1 siRNA质粒分别转染细胞，使CTNND1的表达上调和下调，然后验证其生物学功能。通过Transwell小室，MTS实验，流式细胞技术检测CTNND1的表达对细胞迁移和浸润能力、增殖和凋亡作用的影响。　　5.实时定量PCR检测胃癌组织中miR-145的表达情况，评估miR-145与总体CTNND1的阳性表达率是否存在相关性。同时扩增CTNND13-UTR区序列，构建pmirGLO荧光素酶载体，通过双荧光报告系统检测和western blot分析验证CTNND1是否受到miR-145的调控。　　6.对临床样本中miR-145与膜定位和浆定位的CTNND1的阳性表达率分别进行相关性分析，验证miR-145对CTNND1定位是否具有调节作用。转染miR-145和miR-control,通过细胞免疫荧光技术和western blot实验，观察CTNND1，E-cadherin和N-cadherin的表达及细胞定位的情况。进行N-cadherin siRNA转染，利用细胞免疫荧光技术和western blot实验探讨N-cadherin在miR-145调控CTNND1表达和定位中的作用，进一步阐明miR-145调控CTNND1浆定位抑制胃癌浸润的分子机制。　　7.将转染慢病毒表达载体pEZX-miR-145及pEZX-miR-control的肿瘤细胞注射到裸鼠体内，构建成瘤模型。6周后取出裸鼠中瘤体组织，测量两组裸鼠瘤体组织的直径，并对瘤体切片进行H&E和CTNND1免疫组化染色，观察两组肿瘤组织浸润和CTNND1定位的情况，体内进一步验证CTNND1定位与胃癌浸润的关系。　　结果:　　1.免疫组化结果显示:在非肿瘤胃黏膜组织中，CTNND1定位于细胞膜。相比非肿瘤胃黏膜组织，CTNND1在胃癌组织中表达上调。CTNND1在胃癌组织中的表达有细胞膜和细胞浆两种定位形式，尤以浆定位居多。CTNND1的总体阳性表达只与胃癌的分化程度和Lauren分型相关，与其它临床病理参数无密切联系。而浆表达的CTNND与胃癌的临床分期、T分期、淋巴结和远处转移及Lauren分型情况密切相关。　　2.Kaplan-Meier生存曲线显示胃癌患者的总体生存时间和无瘤生存时间与CTNND1的定位密切有关，而与CTNND1的总体表达情况无关。CTNND1浆定位的肿瘤患者生存期更短，预后更差。　　3.通过Cox回归模型单因素统计分析，发现浆定位CTNND1，UICC临床分期，T分期，淋巴结转移和远处转移都是影响胃癌患者预后的危险因素。多因素统计分析表明浆定位CTNND1是预测胃癌患者预后的独立危险因素。　　4.CTNND1 cDNA质粒转染48h后与Mock control组相比，胃癌细胞SGC7901的迁移和浸润显著增加，同时CTNND1 siRNA转染后SGC7901的迁移和浸润能力又明显下降。MTS实验和流式细胞检测结果显示CTNND1的表达下调后对胃癌细胞的增殖和凋亡没有显著的作用。　　5.本研究结果显示miR-145的表达与CTNND1的阳性表达率存在负相关。荧光素酶实验结果发现miR-145和CTNND1-pmirGLO载体共转染组细胞的荧光强度明显低于对照组。转染miR-145后，western blot实验结果显示CTNND1蛋白表达明显下调。以上结果均提示CTNND1是miR-145调控的直接靶基因。　　6.相关性分析显示miR-145的表达与浆定位CTNND1的表达存在显著的负相关，提示miR-145可能参与了CTNND1定位的调节。细胞免疫荧光实验显示:miR-control转染组的细胞CTNND1主要定位于细胞浆，而miR-145转染组细胞CTNND1定位于细胞膜上。本研究进一步表明miR-145介导了CTNND1由细胞浆向细胞膜定位的改变。随后我们又检测了N-cadherin和E-cadherin的定位情况，发现与miR-control组相比，miR-145转染组细胞N-cadherin蛋白表达有所降低（荧光强度降低但定位没有改变），同时E-cadherin的定位也由细胞浆转变为细胞膜上。为进一步判断N-cadherin在CTNND1和E-cadherin的定位改变的作用，我们将N-cadherin siRNA转染的细胞进行免疫荧光实验，结果发现与对照组相比，N-cadherin siRNA转染组的细胞CTNND1和E-cadherin的表达也出现了膜定位的改变，这说明miR-145介导的CTNND1和E-cadherin定位的改变是通过N-cadherin的表达来实现的。Western blot结果显示转染miR-145和N-cadherin siRNA后，CTNND1总蛋白表达下调，CTNND1膜蛋白表达却增加，而E-cadherin蛋白的表达量没有改变。　　7.动物实验结果表明pEZX-miR-145及pEZX-miR-control两组瘤体的大小没有显著差异。pEZ×-miR-145组瘤体包膜完整，没有出现肌肉浸润的现象，免疫组化结果显示CTNND1主要定位于细胞膜。而pEZX-miR-control组瘤体包膜不完整，出现了肌肉和血管浸润的现象，其中CTNND1主要定位于细胞浆。Western blot检测结果显示pEZX-miR-145组CTNND1蛋白的表达明显低于pEZX-miR-control对照组。　　结论:　　1.CTNND1在胃癌组织中高表达，且主要定位于细胞浆。CTNND1的浆定位与胃癌的临床分期、T分期、淋巴结和远处转移及Lauren分型情况密切相关。　　2.相比CTNND1膜定位的胃癌患者，浆定位的胃癌患者生存时间更短，预后更差。浆定位CTNND1可以作为预测胃癌患者预后的独立影响因子。　　3.浆定位的CTNND1表达上调可以增强胃癌细胞迁移和浸润能力，但对细胞的增殖和凋亡无明显作用。CTNND1有望成为胃癌治疗的靶点。　　4.CTNND1的表达及定位受到miR-145的调控。CTNND1表达上调的原因在于miR-145表达的下调，CTNND1是miR-145的直接靶基因，miR-145不仅能下调浆定位CTNND1的表达，而且还可以介导CTNND1由细胞浆向细胞膜定位的改变。　　5.miR-145一方面可以通过直接下调CTNND1的浆表达发挥抑癌作用，另一方面又通过下调N-cadherin蛋白的表达间接恢复CTNND1和E-cadherin的膜定位，从而起到抑制胃癌浸润的作用。