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一、目的1.在降糖、降压、降脂等治疗的基础上,观察芪葵颗粒治疗早期糖尿病肾病临床疗效及其对病情进展的影响。2.探讨芪葵颗粒对高糖诱导肾小管上皮细胞转分化的影响及其作用机制。二、方法1.临床研究选取2016年5月至2016年10月南京中医药大学附属医院内分泌科门诊或住院符合纳入条件的80例早期DN患者(MogensenⅢ期,气阴两虚、湿瘀阻络证)。随机分为治疗组(芪葵颗粒治疗,n=40)及对照组(厄贝沙坦片治疗,n=40),两组均予以降糖、降压、降脂等基础治疗,治疗组口服芪葵颗粒,每次1包(10g/包),每日3次。对照组口服厄贝沙坦片,每次150mg,每日1次,疗程1年。观察尿微量白蛋白/肌酐(UACR)、肾功能(BUN、SCr、Cys-c、eGFR)、进入 Mogensen Ⅳ期病例数、血糖(FBG、HbA1C)、血脂(TC、TG)、血压(SBP、DBP)及中医证候积分的变化。2.实验研究含药血清制备:SD大鼠12只随机分为对照组、芪葵颗粒(低、中、高)剂量组,每组3只,灌胃给药。芪葵颗粒低、中、高剂量组分别按照1.35g·kg-1 2.7g·kg-1 5.4g.kg-1的剂量灌胃,每日1次,连续7天,于第7天、末次灌胃2h后颈动脉取血,制备含药血清。以HK-2细胞为研究对象,实验分组:对照组(6%对照组鼠血清+5.5mmol/LGS,NC)、高渗组(6%对照组鼠血清+5.5mmol/LGS+24.5mmol/L甘露醇,HC)、高糖组(6%对照组鼠血清+30mmol/LGS,HG)、芪葵颗粒低剂量组(6%芪葵颗粒低剂量组鼠血清+30mmol/L GS,QKL)、芪葵颗粒中剂量组(6%芪葵颗粒中剂量组鼠血清+30mmol/LGS,QKM)、芪葵颗粒高剂量组(6%芪葵颗粒高剂量组鼠血清+30mmol/L GS、QKH),Rho抑制剂组(6%对照组鼠血清+Y-27632+30mmol/L GS,Rho inhibitor),培养48h。采用相差显微镜,观察各组细胞形态学变化;免疫荧光半定量分析和RT-PCR检测各组细胞α-SMA、FSP-1、E-cadherin蛋白和mRNA表达;ELISA法检测各组细胞上清液中FN分泌量;Western blot法检测各组细胞 RhoA、ROCK1、PMYTP-Thr853、PMYTP-Thr696 蛋白表达。三、结果1.临床研究①病例完成情况:在观察期间,治疗组2例未按规定服用药物,予以剔除,完成38例;对照组3例服用了影响疗效判定的药物,其中2例患者服用黄葵胶囊,1例患者服用替米沙坦片,4例未在1年疗程后复查各项检测指标,完成33例。②疾病疗效比较:总有效率治疗组优于对照组(P<0.05)。③UACR比较:两组治疗后UACR均较治疗前下降(P<0.05,0.01),治疗组下降幅度大于对照组,组间比较有统计学意义(P<0.05)。④两组治疗1年进入Mogensen ⅣV期病例数比较.:治疗组有2例进入ⅣV期,对照组有7例进入Ⅳ期,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。⑤肾功能、血糖、血脂、血压比较:两组治疗前后肾功能、血糖、血脂、血压均无明显变化(P>0.05)。⑥中医证候疗效比较:总有效率治疗组优于对照组(P<0.01)。⑦中医证候积分比较:治疗组中医证候总积分下降幅度大于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组在改善倦怠乏力、腰膝酸软、下肢水肿、尿浊症状方面,优于对照组(P<0.05,0.01)。⑧不良反应:治疗期间两组患者均未见明显不良反应。2.实验研究①细胞形态学变化:与对照组比较,高渗组细胞形态无明显改变;高糖组细胞呈梭形,丧失其铺路石样生长方式,生长时呈放射状,排列紊乱,少部分细胞脱落;芪葵颗粒低、中、高剂量及Rho抑制剂组细胞形态均有所改善。②α-SMA、FSP-1、E-cadherin蛋白表达:与对照组比较,高渗组α-SMA、FSP-1、E-cadherin蛋白表达无明显差异(P>0.05),高糖组α-SMA、FSP-1蛋白表达明显增多(P<0.05),E-cadherin蛋白表达明显减少(P<0.05);与高糖组比较,芪葵颗粒低、中、高剂量及Rho抑制剂组α-SMA、FSP-1蛋白表达明显减少(P<0.05),E-cadherin蛋白表达明显增多(P<0.05);与Rho抑制剂组比较,芪葵颗粒低、中、高剂量组α-SMA、FSP-1、E-cadherin蛋白表达无明显差异(P>0.05)。③ α-SMA、FSP-1、E-cadherin mRNA 表达:与对照组比较,高渗组 α-SMA、FSP-1、E-cadherin mRNA表达无明显差异(P>0.05),高糖组α-SMA、FSP-1mRNA表达水平明显上调(P<0.05),E-cadherin mRNA表达水平明显下调(P<0.05);与高糖组比较,芪葵颗粒低、中、高剂量及Rho抑制剂组α-SMA、FSP-1mRNA表达水平明显下调(P<0.05),E-cadherinmRNA表达水平明显上调(P<0.05);与Rho抑制剂组比较,芪葵颗粒低、中、高剂量组α-SMA、FSP-1、E-cadherin mRNA表达水平无明显差异(P>0.05)。④细胞上清液FN分泌量:与对照组比较,高渗组细胞上清液FN分泌量无明显差异(P>0.05),高糖组细胞上清液FN分泌量明显升高(P<0.05);与高糖组比较,芪葵颗粒中、高剂量及Rho抑制剂组细胞上清液FN分泌量明显下降(P<0.05);与Rho抑制剂组比较,芪葵颗粒中、高剂量组细胞上清液FN分泌量无明显差异(P>0.05)。⑤RhoA、ROCK1、PMYTP-Thr853、PMYTP-Thr696 蛋白表达:与对照组比较,高渗组 RhoA、ROCK1、PMYTP-Thr853、PMYTP-Thr696 蛋白表达无明显差异(P>0.05),高糖组 RhoA、ROCK1、PMYTP-Thr853、PMYTP-Thr696蛋白表达明显升高(P<0.05);与高糖组比较,芪葵颗粒低、中、高剂量组、Rho 抑制剂组 RhoA、ROCK1、PMYTP-Thr853、PMYTP-Thr696 的蛋白表达明显下降(P<0.05);与Rho抑制剂组比较,芪葵颗粒低、中、高剂量组RhoA、ROCK1、PMYTP-Thr853、PMYTP-Thr696 蛋白表达无明显差异(P>0.05)。四、结论1.在降糖、降压、降脂等治疗的基础上,芪葵颗粒可以降低早期DN微量白蛋白尿水平,延缓病情进展,改善气阴两虚、湿瘀阻络证患者倦怠乏力、腰膝酸软、下肢水肿、尿浊症状。2.芪葵颗粒有抑制肾小管上皮细胞EMT的作用,其机制很可能与干预RhoA/ROCK1信号通路有关。