论文部分内容阅读
前言类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一种病因未明,以反复发作的慢性小关节炎为主的疾病,其特征为关节滑膜增生以及关节软骨与软骨下骨的破坏。导致患者关节畸形、功能丧失以致生活能力下降的主要因素是软骨和骨的破坏。目前尚无有效抑制该进程的方法。在骨关节炎动物模型中观察到,骨保护素(Osteoproegein, OPG)可以有效抑制软骨和软骨下骨的破坏。在佐剂诱导关节炎动物模型(Adjuvant-induced arthritis, AIA)中也发现,经OPG治疗的大鼠膝关节软骨组织得到近乎完全保护。但是有报道指出胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)相对于AIA,其关节破坏更明显,更加接近于RA软骨的破坏。所以OPG对RA关节炎软骨的作用尚需进一步研究。而且,OPG抑制关节炎软骨破坏的病理机制尚未明了。软骨基质主要由纤维状的胶原蛋白网络和聚集的蛋白聚糖组成。软骨细胞是唯一的细胞成分,负责调节软骨的代谢。正常情况下,软骨细胞产生软骨基质。分泌多种因子,并在局部达到平衡,以调节软骨的新陈代谢和软骨基质的平衡。简言之,分解代谢因子,如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)-1、3,9.13或解聚素和金属蛋白酶与血小板反应蛋白基序(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs, ADAMTS)-4,5可降解软骨的基质,而TIMP-1、2、3、4, IGF-I, TGF-β, BMP-2, bFGF等可以促进软骨基质合成,从而抑制MMPs等的作用,进而达到平衡,以保持软骨的自我更新。超负荷的压力或者炎症因子如IL-1, TNF-a等刺激可能打破软骨代谢的平衡,从而导致软骨基质降解和破坏。研究显示RA患者软骨破坏的主要原因是增生的滑膜和炎症细胞的侵蚀,但是至今并无能同时抑制滑膜炎症和软骨破坏的药物。从软骨破坏的内在机制,如软骨细胞凋亡和蛋白多糖丢失着手进一步探索,可能具有重大的临床意义。Kim等人发现,在RA患者关节软骨细胞较非RA患者软骨细胞的凋亡率显著增加。并且凋亡因子caspase3的表达在RA患者及动物模型的软骨中均明显增加。此外,通过番红O染色评估发现在CIA模型动物中蛋白聚糖丢失更为显著。表层的蛋白聚糖丢失通常是关节软骨破坏的第一步,在蛋白聚糖的降解中,ADAMTS-4,-5是主要的降解酶。本课题首次对OPG影响软骨细胞生长和功能进行系统的研究,体外细胞实验与动物体内实验相结合,在分子生物学,细胞学和病理组织学水平探索OPG对软骨细胞的影响,并初步探讨OPG抑制RA软骨破坏的机制：1)体外验证OPG对软骨细胞的增殖能力的影响；2)探索OPG影响软骨细胞的细胞内信号通路；3)探讨OPG对软骨细胞分泌细胞因子能力的影响；4)构建携带OPG基因的腺病毒,构建RA关节炎模型CIA；5)评价OPG基因治疗CIA大鼠后的关节软骨破坏；6)探讨软骨细胞凋亡在CIA软骨破坏中的作用以及OPG基因治疗对软骨细胞凋亡的影响；7)评价OPG基因治疗后ADAMTS-5的分泌水平的改变。第一部分骨保护素对体外软骨细胞增殖及分泌功能的影响目的体外研究骨保护素(osteoprotegerin, OPG)对软骨细胞增殖能力和分泌功能的影响。方法从1周龄SD大鼠的膝关节中,采用胶原酶消化法获取原代软骨细胞。甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞。本实验应用第一代软骨细胞。细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)检测5,10,20,25,50,100,200ng/ml浓度OPG对软骨细胞增殖能力的影响。以MEK抑制剂U0126, ERK抑制剂PD098059, P38MAPK抑制剂SB203580预处理30分钟,再加入OPG刺激,进行CCK-8试验,用以探索OPG对软骨细胞通路的影响。MAPK家族中的三条信号通路关键蛋白ERK, P38MAPK和JNK由蛋白质免疫印迹法(western-blotting)检测刺激后磷酸化水平。定量PCR和western-blotting测定OPG刺激后软骨细胞分泌的细胞因子和组成成分表达量的变化。结果OPG在5-50ng/ml浓度能促进软骨细胞增殖,最佳效应浓度为10ng/ml。 U0126,PD098095可以显著抑制OPG诱导的软骨细胞增殖。OPG刺激后15分钟,软骨细胞内MEK和ERK蛋白的磷酸化分别增强至0分钟时的4.12倍和3.50倍,而P38MAPK和JNK的蛋白磷酸化则无明显变化。OPG显著下调软骨细胞ADAMTS-5分泌,上调TIMP-4的分泌,但对TIMP-1、2、3、IGF-I, TGF-p, bFGF, BMP-2, ADAMTS-4, Collegan-II, Aggrecan的表达无显著影响。同样,ERK蛋白抑制后,OPG诱导ADAMTS-5和TIMP-4的表达改变也被抵消。结论OPG通过MEK/ERK信号通路促进软骨细胞的增殖。同时,OPG能下调ADAMTS-5表达和上调TIMP-4的表达。第二部分腺病毒介导的骨保护素基因治疗对胶原诱导关节炎软骨破坏的抑制作用及其机制探讨目的研究腺病毒介导的OPG基因(adenovirus-mediated OPG, Ad-OPG)治疗对胶原诱导的关节炎模型(collagen-induced arthritis, CIA)大鼠软骨的保护作用,并探索可能的作用机制。方法取40只8周龄雄性SD大鼠诱导CIA模型。先以高速转头将牛胶原和弗氏不完全佐剂制备成乳化剂,然后以0.1ml乳剂尾根部皮下免疫SD大鼠。将CIA大鼠随机分成4组,早期治疗组(n=10)于关节炎出现后即注射30ul Ad-OPG病毒(108pfu/ml),晚期治疗组(n=7)于关节炎出现注射等量Ad-OPG病毒,病毒对照组(n=13)注射Ad-GFP病毒, CIA对照组(n=7)注射PBS。正常对照组为无治疗的正常同龄大鼠。正常对照组为无治疗的正常同龄大鼠。在注射Ad-GFP病毒后2,7,14,21,28天分别处死1只大鼠,荧光显微镜观察GFP蛋白表达的量和分布。治疗后4周处死大鼠,取组织和血液样本,对组织进行染色后病理学评估,对血清样品进行ELISA检测软骨寡聚基质蛋白(COMP)和白介素-1(IL-1β)。结果成功诱导出37只CIA大鼠。荧光显微镜证实CIA大鼠关节中GFP的持续高表达。早期和晚期Ad-OPG注射均抑制蛋白聚糖丢失,但只有早期治疗才能同时降低软骨破坏评分和COMP的血清水平。TUNEL检测发现,早期和晚期AD-OPG治疗均显著抑制CIA大鼠软骨细胞凋亡,但只有早期AD-OPG治疗的caspase3的表达显著下降。ADAMTS-5阳性细胞的数量在早期和晚期Ad-hOPG治疗后均显著下降。Ad-OPG治疗不能显著改变CIA大鼠踝关节肿胀和IL-1p表达水平。结论早期Ad-OPG治疗显著抑制CIA大鼠的软骨破坏,其机制可能是通过抑制软骨细胞凋亡实现。此外,OPG可以通过抑制ADAMTS-5的表达而直接抑制CIA中软骨聚糖丢。