目的多种癌症可以发生骨转移,如乳腺癌、肺癌、肾癌,肿瘤细胞、成骨细胞、破骨细胞和骨基质细胞分泌的细胞因子相互作用共同促进了肿瘤骨转移的形成和发展。肿瘤细胞释放的某些因子促使骨转移及骨破坏的形成,骨破坏后骨微环境中的多种细胞因子趋化肿瘤转移至骨并促进肿瘤的生长,这一恶性循环中的多种因子甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP),转化生长因子-β(TGF-β),核因子κB受体活化因子(RANK)近来成为研究热点。其中PTHrP在某些肿瘤组织中过度表达,其作为主要的破骨细胞活性介导因子之一,诱导破骨细胞分化和成熟,在癌症溶骨性骨转移及骨破坏的发生发展中起着重要作用。以乳腺癌为例,多数研究表明PTHrP在乳腺癌骨转移过程中具有非常重要的作用。但也有人提出PTHrP在乳腺癌原发灶中的表达可以改善预后,使癌细胞侵袭性降低,提高患者生存质量。本研究主要目的是制备小鼠乳腺癌模型,人为持续给予大剂量PTHrP1-34,结合全身X线、疑有病变骨组织的病理切片、离体骨生物力学试验、股骨灰干重比等指标,并测定骨转换血清生化标志物,同时对瘤体进行观察与测量,研究持续性大剂量PTHrP1-34对小鼠乳腺癌骨转移及骨代谢的影响,为明确开发抗-PTHrP抗体来抑制肿瘤骨转移是否有意义奠定基础。方法预实验中分别采用肿瘤细胞悬浊液注射法和肿瘤组织块悬浊液注射法制备小鼠乳腺癌模型,且两组各随机选取1只,剥离肿瘤块做病理切片证实为乳腺癌,以选取较好的荷瘤鼠造模方法,结果得出后者为佳。40只4-6周龄BALB/C小鼠,实验前适应性喂养1周,按体重编号,采用随机数字法将其随机分为三组,1组12只作为正常对照组(对照组),2、3组各14只,前肢腋下皮下注射乳腺癌组织块悬浊液制备小鼠乳腺癌模型,10天后以肿瘤长径大于4mm做为造模成功鼠,最后入选的小鼠每组各12只。成模后,2组每日予以生理盐水腹腔注射(模型组),3组每日予以PTHrP1-34400μg/kg腹腔注射(实验组)。实验期间,每周固定时间测小鼠体重,观察肿瘤生长情况,持续40d后摘眼球取血处死,测定血清中反映骨转换的生化指标水平,包括钙(Ca)、磷(P)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)、I型胶原C-末端交联顶端肽β(β-CTX)、骨唾液酸蛋白(BSP),处死前行全身骨X线扫描,观察骨破坏情况,定位疑有病变部位,测全身BMD(DEXA法),剥离肿瘤测其大小与重量,留取腰椎、股骨、胫骨等标本,用万能材料分析仪行腰椎(L5)压缩试验及股骨三点弯曲试验并行骨矿含量测定,疑有病变的胫骨制备脱钙骨石蜡切片、HE染色,进行病理学观察。所有数据均以均数±标准差(x—±SD)表示,采用SPSS13.0统计软件进行分析,计量样本均数组间的比较用独立样本t检验,组间比较采用单因素方差分析,率的比较采用四格表资料确切概率法,P﹤0.05有统计学意义。结果1、荷瘤小鼠成模情况:预试验中分别采用肿瘤细胞悬浊液注射法和肿瘤组织块悬浊液注射法制备小鼠乳腺癌模型,前者造模成功率87.5%,且成瘤时间不一,大小不均;后者可以形成成瘤时间、大小一致的荷瘤鼠,且成瘤率100%,本实验中采取肿瘤组织块悬浊液注射法造模。2、骨X线、局部解剖学及脱钙骨石蜡切片观察:模型组与对照组相比较,除1只外其余均未见明显骨破坏现象,而实验组有6只存有明显的溶骨性骨破坏现象,以胫骨近端为明显,其中1只左后肢胫骨骨折。率的比较用四格表资料确切概率法得出两组荷瘤小鼠骨破坏发生率差异有统计学意义(P<0.01)。取骨病理切片显示为转移瘤。3、BMD与股骨灰干重比的比较:对照组、模型组与实验组BMD、股骨灰干重比分别为62.43±2.22(g/cm2)、0.590±0.286,61.88±2.02(g/cm2)、0.579±0.195,54.83±1.93(g/cm2)、0.552±0.270,与对照组和模型组相比,实验组BMD及股骨灰干重比显著降低,差异有统计学意义(P<0.01),与对照组相比,模型组BMD及股骨灰干重比有降低趋势,差异无统计学意义(P>0.05)。4、骨生物力学特性:与对照组相比,实验组小鼠股骨最大载荷降低了12.37%、弹性载荷降低了11.72%、截面惯性矩降低了19.4%、弹性模量降低了26.16%、腰椎最大载荷降低了34.71%;与模型组比较,实验组小鼠股骨最大载荷降低了13.12%、弹性载荷降低了15.61%、截面惯性矩降低了17.24%、弹性模量降低了15.47%、腰椎最大载荷降低了32%。与对照组和模型组比较,实验组各指标均降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),对照组与模型组间无显著性差异。5、血清中Ca、P、ALP、β-CTX、BSP、BGP等骨转换生化标记物水平:三组小鼠间血清Ca水平差异均无统计学意义。与对照组相比实验组P、BSP、β-CTX等反映骨吸收的指标分别升高了31.5%、31.58%、81.25%,血清总ALP、BGP等反映骨形成的指标分别降低了19.57%、17.43%;与模型组相比,实验组P、BSP、β-CTX分别升高了21.92%、14.93%、58.82%,ALP、BGP分别降低了12.48%、11.54%,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与对照组相比,模型组血清P、BSP(P=0.064)有升高趋势,ALP、BGP有降低趋势,但差异均无统计学意义(P>0.05)。6、荷瘤小鼠肿瘤大小及重量比较:模型组肿瘤质量0.859±0.176(g),体积297.07±106.70(cm3),实验组肿瘤质量1.123±0.192(g),体积824.18±189.79(cm3)。与模型组比较,实验组肿瘤生长快、质量、体积大,差异有统计学意义(P<0.01)。7、三组小鼠体重的变化:与对照组比较,模型组和实验组小鼠体重增长明显缓慢,实验结束时对照组、模型组与实验组体重增长总量分别为6.15±1.00(g)、4.64±1.31(g)、3.73±0.87(g),后两者均显著低于对照组(P<0.01),而模型组与实验组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论1、小鼠乳腺癌细胞MA-782可以在BALB/c小鼠身上成功建立乳腺癌模型,其中肿瘤组织块悬浊液法可以形成成瘤时间、大小一致的荷瘤鼠,是研究人类乳腺癌发生、发展、转移等各种机制较理想的动物模型。2、Ca、P、ALP、β-CTX、BSP、BGP等血清生化指标、骨生物力学、全身骨X线扫描,都可以用于辅助判断肿瘤骨转移及溶骨性骨破坏,其中对乳腺癌患者的研究表明,血清BSP增加可以提示早期骨转移,骨组织病理切片可以确诊肿瘤骨转移。由于小鼠BMD较小,其比较意义并不大。3、荷瘤小鼠在PTHrP1-34作用下形成骨转移性后,可能是骨破坏后释放的一系列细胞因子通过某种机制促进了肿瘤的生长,使得实验组肿瘤体积与质量较大,同时PTHrP可能具有直接促进肿瘤生长的作用。另外,荷瘤小鼠的病理状态影响了其生长发育,使得体重增长缓慢。4、长期给与大剂量PTHrP1-34后,荷瘤小鼠血清P、BSP、β-CTX等反映破骨细胞活性和骨吸收状态的指标升高,ALP、BGP等反映成骨状况的指标降低,且骨矿含量、骨生物力学特性、骨强度均降低,BSP的显著升高以及病理切片证实了确实存在肿瘤骨转移。说明在PTHrP的作用下,乳腺癌骨转移率升高,骨转移瘤和PTHrP双重作用使得骨破坏大于骨生成,造成了骨损伤,同时PTHrP直接或间接促进了肿瘤的生长。为下一步研发抗-PTHrP抗体来抑制肿瘤骨转移、提高患者生存质量奠定了基础。