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以树突状细胞（Dentritic cell,DC）为核心的肿瘤免疫治疗是近年来研究热点之一。致敏DC疫苗的方法中,较为常用的是聚乙二醇法（Polyethylene glycol,PEG）,将DC与肿瘤细胞直接融合,能表达所有已知的和未知的肿瘤抗原,从而更有效的刺激T细胞增殖活化。很多研究已证明了DC/肿瘤杂交细胞疫苗能够较好的活化CD4+T细胞和CD8+T细胞发挥抗肿瘤作用,但是临床试验并不那么理想。提示有可能存在破坏这些疫苗抗肿瘤的免疫机制。那么探究其中的免疫抑制机制对于日后提高DC/肿瘤杂交细胞疫苗疗效很有必要。DC疫苗的最终目的是激发强大和持久的CD4+T细胞和CD8+T细胞反应以清除肿瘤细胞。然而,本研究发现DC/肿瘤融合细胞疫苗除了诱导产生抗肿瘤作用的CD4+T细胞和CD8+T细胞外,还存在着一类调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）。经鉴定这群调节性T细胞为CD8ααTregs,是由CD4+T细胞转化的一群新的CD8ααTregs亚群。研究报道的CD8ααTregs来自三阳性胸腺细胞（CD4+CD8αβ+CD8αα+）,经过阳性选择,变成单阳性的胸腺细胞,迁移到小肠。CD8ααTregs通过识别MHC-Ib分子Qa-1,抑制病理性的CD4+T细胞,在体内,自然环境下,CD4+T细胞能否转化为CD8ααTregs尚未见报道。因此,探讨体内,无任何刺激物的诱导下,CD4+T细胞是否可以转化为CD8ααTregs及其可能的机制,将为了解T细胞发育的过程提供参考,也为相关的抗肿瘤免疫和自身免疫性疾病的治疗提供新的方法。Notch信号通路是调控胚胎发育和细胞分化的重要信号通路。Notch的配体与受体结合后,被γ-分泌酶切割释放活性片段ICN,移位到细胞核,与转录因子RBP-J（Recombination signal binding protein-Jκ,RBP-J）结合,从而激活下游靶基因,从多个方面参与T细胞发育及功能的调控,包括T细胞的活化和增殖等。本研究通过使用γ-分泌酶的抑制剂DAPT（N-[N-（3,5-Difluorophenacetyl）-L-alanyl]-S-phenylglycinet-t-Butyl Ester,DAPT）和RBP-J基因条件性敲除小鼠来验证Notch信号通路是否介导了CD4+T细胞向CD8ααTregs转化。本研究进一步探讨了来源于CD4+T细胞的CD8ααTregs亚群生物学特性,以及这群细胞对肿瘤杂交细胞疫苗抗肿瘤作用的影响,对自身免疫疾病治疗的潜在临床意义。第一部分CD4+T细胞转化为一群新的CD8ααTregs亚群目的:在体内外验证CD4+T细胞能否转化为CD8ααTregs。方法:用流式细胞仪检测体外和体内DC/肿瘤融合细胞疫苗诱导CD4+T细胞转化的CD8ααTregs频率,分析DC/肿瘤融合细胞疫苗诱导CD4+T细胞转化的CD8ααTregs表型。将GFP+C57BL/6背景转基因小鼠的CD4+T细胞输入野生型C57BL/6受体小鼠体内,用流式细胞仪检测受体小鼠脾脏、淋巴结中由CD4+T细胞转化CD8ααTregs的百分率,分析这一新CD8ααTregs亚群的表型。结果:流式结果表明,DC/肿瘤融合细胞疫苗能诱导CD4+T细胞转化为CD8ααTregs。将CD4+T细胞输入小鼠体内的第五天,在淋巴结、脾脏中检测到CD4+T转化为CD8ααTregs的百分率分别为90.8%、82.5%。这群新的CD8ααTregs表达CD129、CD94、PD-1、CD44分子。结论:本研究发现DC/肿瘤融合细胞疫苗在诱导T细胞活化过程中,同时诱导了CD4+T细胞转化为一群新的CD8ααTregs亚群。在体内无任何刺激物的诱导下,CD4+T细胞也能转化为一群新的CD8ααTregs亚群。第二部分CD4+T细胞转化为新的CD8ααTregs亚群生物学功能研究目的:研究CD4+T细胞转化为新的CD8ααTregs亚群的生物学功能。方法:用流式细胞仪检测体外和体内由CD4+T细胞转化的CD8ααTregs分泌细胞因子的情况及抑制活化CD4+T细胞增殖、杀伤活化CD4+T细胞能力。结果:这群新的CD8ααTregs亚群能分泌IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-2、TGF-β等细胞因子,抑制活化的CD4+T细胞增殖并杀伤活化CD4+T细胞,对未活化的CD4+T细胞没有影响。结论:这一新的CD8ααTregs亚群能够抑制机体的CD4+T细胞免疫反应。第三部分CD4+T细胞转化为新的CD8ααTregs亚群机制研究目的:阐明CD4+T细胞转化为新的CD8ααTregs亚群的机制。方法:用Notch信号通路阻断剂DAPT进行阻断后,检测DC/肿瘤融合细胞疫苗诱导CD4+T细胞转化CD8ααTregs转化的频率。将Notch信号通路的阻断剂DAPT输入受体小鼠,再将GFP+CD4+T细胞输入该受体小鼠,用流式细胞仪检测受体小鼠脾脏、淋巴结CD4+T细胞转化的CD8ααTregs的百分率。将GFP+CD4+T细胞输入的RBP-J基因敲除小鼠体内,流式检测RBP-J基因敲除小鼠脾脏和淋巴结CD8ααTregs的百分率。结果:经过DAPT阻断后,DC/B16融合细胞不能够诱导CD4+T细胞转化为CD8ααTregs。GFP+CD4+T细胞输入用DAPT阻断的小鼠体内,CD4+T细胞转化为CD8ααTregs的百分率明显减少。将GFP+CD4+T输入的RBP-J基因敲除小鼠体内,来源于CD4+T细胞的CD8ααTregs明显减少。结论:Notch信号通路介导了CD4+T细胞向新的CD8ααTregs亚群转化。第四部分由CD4+T细胞转化为新的CD8ααTregs亚群对DC/肿瘤融合细胞疫苗抗癌作用的影响目的:探讨DC/肿瘤融合细胞疫苗诱导的CD4+T细胞转化为新CD8ααTregs亚群对其抗癌作用的影响。方法:将这群新的CD8ααTregs输入荷瘤小鼠体内观察其对肿瘤生长的影响。DC/肿瘤融合细胞疫苗联合DAPT治疗荷瘤小鼠的疗效观察,用抗CD4抗体进行封闭后,再观察DC/肿瘤融合细胞疫苗联合DAPT治疗荷瘤小鼠的疗效。结果:由CD4+T细胞转化的新CD8ααTregs促进体内肿瘤的生长,缩短荷瘤小鼠的寿命。DAPT能够促进DC/肿瘤融合细胞疫苗的抗肿瘤作用。用抗CD4抗体进行封闭后,DAPT不能够促进DC/肿瘤融合细胞疫苗的抗肿瘤作用。结论:通过DAPT阻断Notch信号通路能够促进DC/肿瘤融合细胞疫苗的抗肿瘤作用,为DC/肿瘤融合细胞疫苗应用于临床开辟新的视野。第五部分由CD4+T细胞转化为新的CD8ααTregs亚群治疗EAE研究目的:研究由CD4+T细胞转化为新的CD8ααTregs亚群治疗EAE疾病方法:构建EAE疾病模型,将新的CD8ααTregs亚群输入EAE小鼠,观察各组EAE小鼠的临床评分,评价其疗效。结果:CD8ααTregs亚群治疗组临床评分显著低于PBS对照组,并且明显缓解中枢神经系统的言行浸润。结论:由CD4+T细胞转化的新CD8ααTregs亚群具有应用于EAE治疗的前景。