植物药长期用于各种传统医学实践中,特别是在亚洲各国应用极其广泛。然而,有关植物药的安全性评价研究则多有欠缺。而且人们常常把它们当做家庭用药,与处方药联合使用,这就进一步造成了用药安全问题。这也使得有关食品或植物药引起的相互作用得到了实质性的关注,并通过大量的研究来完善这一特定领域的认知。深入了解植物药-西药相互作用的作用机制,对于评价和减少由于药物联合应用所引起的临床风险,特别对于治疗指数较窄的西药,有着不可或缺的作用。其中,中药提取物通过药物代谢酶引起相互作用的潜在性研究,有助于临床医师评估中草药治疗的安全性和有效性。本论文主要由两部分构成：文献综述和实验研究。实验研究目的主要是通过对3种中药单体成分(延胡索乙素、甲基莲心碱和小檗碱)对细胞色素P450 (CYP)酶的体外抑制作用及其机制的研究,评价这3种中药成分与传统西药合用时产生药物相互作用的可能性。并且,在体外实验基础上,采用Cocktail探针药物法,进一步研究其延胡索乙素对CYP1A2、2D6和3A4酶探针药物在Beagle犬体内代谢的影响,以期探讨临床应用时出现相关中药-西药相互作用的可能性。1.文献综述对本论文的研究背景进行了文献综述,包括植物药应用及其植物药-西药相互作用现状,细胞色素P450酶及其介导的植物药-西药相互作用,检测细胞色素P450酶介导相互作用的方法,以及本研究中3种中药单一成分应用及其相关的药物相互作用。2.实验研究(1)延胡索乙素、甲基莲心碱和小檗碱对人细胞色素1A2、2D6、3A4酶的体外抑制作用本实验采用了酶体外孵育方法,以3种人重组细胞色素P450酶1A2、2D6和3A4为主要CYP代谢酶,研究3种中药单一有效成分(延胡索乙素、甲基莲心碱和小檗碱)对上述3种CYP酶代谢活性抑制作用。在体外酶反应实验中,分别以非那西丁,右美沙芬和睾酮为细胞色素P450酶1A2、2D6和3A4的特异性底物,采用HPLC方法测定其代谢产物含量,并以代谢产物的产生量来计算CYP酶活性。在本实验中,用IC50值评价抑制作用的大小,以α-萘黄酮、奎尼丁和酮康唑分别作为CYP1A2、2D6和3A4的阳性对照抑制剂。本实验结果显示,3种中药单体成分对所观察的CYP酶均具有不同程度的抑制作用。其中,CYP2D6的抑制作用最为显著,延胡索乙素和小檗碱的IC50值分别为3.04±0.261μM和7.40±0.36μM。此外,3种中药成分也对CYP3A4和CYP1A2也有一定的抑制作用,抑制作用强度依次为CYP2D6> CYP3A4>CYP1A2。在三种中药成分中,甲基莲心碱对所检测CYP酶的抑制作用最弱。结合中药成分结构分析显示,中药成分对CYP酶的抑制作用强度可能与他们的化学结构有关。实验结果提示,延胡索乙素和小檗碱对CYP2D6和CYP3A4酶的抑制作用,可能会使其与其它药物合用时产生临床相关的代谢性相互作用。(2)延胡索乙素、甲基莲心碱和小檗碱对人细胞色素P450酶的体外抑制机制研究在本实验中,采用了酶体外孵育方法,以3种人重组细胞色素P450酶1A2、2D6和3A4为主要CYP代谢酶,研究3种中药单一有效成分(延胡索乙素、甲基莲心碱和小檗碱)对上述3种CYP酶代谢活性的抑制作用机制。在体外酶反应实验中,分别以非那西丁,右美沙芬和睾酮为CYP1A2、2D6和3A4酶的特异性底物,采用HPLC方法测定其代谢产物含量,并以代谢产物的产生量来计算CYP酶活性。在本实验中仍以α-萘黄酮、奎尼丁和酮康唑分别作为CYP1A2、2D6和3A4酶的阳性对照抑制剂。分别用时间依赖性、NADPH依赖性抑制作用试验和Lineweaver-Burk法,来分别评价其可逆性抑制作用和不可逆性抑制作用(机制基础性抑制作用)机制。为了进一步分析其抑制作用机制,本实验还采用了Discovery Studio CDOCKER软件进行中药成分与CYP酶之间相互作用计算机化模拟。实验结果显示,3种中药成分对CYP3A4酶均显示出相近且显著的机制基础性抑制作用。此外,延胡索乙素对CYP1A2和2D6酶也能产生机制基础性抑制作用,而小檗碱仅对CYP2D6产生机制基础性抑制作用,而甲基莲心碱和小檗碱对CYP1A2均未显示出机制基础性抑制作用。可逆性抑制研究结果提示,延胡索乙素和小檗碱均对CYP2D6和3A4酶,同时具有可逆性抑制作用。计算机化模拟酶-化合物相互作用分析结果显示,延胡索乙素和小檗碱对CYP1A2、CYP2D6和CYP3A4酶的特异性氨基酸残基均能展示出氢键和孔键结合作用。上述实验结果表明,延胡索乙素和小檗碱对CYP2D6和3A4酶活性即具有可逆性又具有不可逆性抑制作用,提示延胡索乙素和小檗碱在临床治疗中与上述两种酶底物药物联合应用时,极有可能会产生相关的中药-西药相互作用。(3)延胡索乙素对Beagle犬体内CYP1A2、2D6和3A酶探针药物的代谢影响延胡索乙素是由传统中药提取出的单一有效成分,具有多种药理作用,并频繁应用于临床实践。特别在中国一直被广泛应用,近年来其应用也显著增加。本实验中采用Cocktail探针药物法(Cocktail probe法),研究延胡索乙素单次给药和多次给药对Beagle犬体内CYP1A2、2D6和3A酶活性的影响。在体内实验中,分别以咖啡因(3.0mg/kg),美托洛尔(2.33mg/kg)和咪达唑仑(0.45mg/kg)作为CYP1A2、2D6和3A酶的Cocktail特异性底物,采用HPLC法定量检测底物及其主要代谢产物血浆浓度,以底物及其代谢产物血浆中含量的变化,显示体内CYP酶代谢活性的变化。将6只雄性Beagle犬采用随机分为对照组和给药组。实验分为2个阶段。第1阶段：延胡索乙素首次(D1)灌胃给药(12mg/kg)的同时,灌胃给予含有3种CYP酶特异性底物的Cocktail探针药物,分别于药前及药后10min、20min、30min、45min、1h、1.5h、2h、 3h、4h、6h、8h、12h和24h取血,进行24h内药代动力学研究；此后,延胡索乙素连续灌胃给药(每天给药3次,每次12mg/kg,给药间隔约8h)4天,于D6,延胡索乙素和Cocktail探针药物同时灌胃给药,再次进行24h内药代动力学研究。第1阶段结束后,经过7天洗脱期,将对照组和给药组交叉对调,进行第2阶段实验,研究方法与第1阶段相同。本实验结果采用非房室模型,模拟计算各组的代谢参数,以Cmax、Tmax、AUC0-24h和AUC0-24h比作为主要代谢参数,对比两组之间的差异,评价其给药后对CYP酶活性的抑制作用。本实验结果显示,延胡索乙素对Beagle犬体内咖啡因和美托洛尔药物代谢显示出及其微弱的影响,提示其对CYP1A2和2D6酶代谢活性无显著作用。然而,相当于临床用量的延胡索乙素,无论单次或多次给药,均能显著增加咪达唑仑AUC0-24h(单次或多次给药分别增加39%或57%)、显著降低1-羟基咪达唑仑与咪达唑仑AUC (0-24h)比(单次或多次给药分别增加29%或22%),与对照组比较均有显著差异,提示其可能是通过CYP3A酶的抑制作用而引起咪达唑仑的体内累积。这与我们前面的体外CYP3A4酶实验结果相一致。本实验结果提示,延胡索乙素及其相关中药的广泛应用于临床,可能会带来由CYP3A酶介导的中药-西药相互作用,有必要通过临床研究进一步确定其可能存在的药物相互作用。3.结论体外实验结果显示,3种中药生物碱,延胡索乙素、甲基莲心碱和小檗碱,对人CYP3A4、2D6和1A2酶活性均能产生一定的体外抑制作用,其作用强度与生物碱的结构有关。而且,延胡索乙素和小檗碱均对CYP2D6和3A4酶,不仅具有可逆性抑制作用,而且具有不可逆性抑制作用,提示其对CYP2D6或CYP3A4酶抑制作用,均可能产生临床相关的中西药物代谢性相互作用。在此基础上,体内实验结果也证实,相当于临床剂量的单次或多次给药后,延胡索乙素可以通过CYP3A酶抑制作用而产生的咪达唑仑积累,暗示当其与其它药物合用时很可能产生临床相关的药物相互作用。