【摘 要】
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近年来,随着养猫人群的增加,猫上呼吸道疾病（FURD）因是引起幼猫发病和死亡的重要原因之一而逐渐被关注。FURD典型临床症状主要表现为发烧、食欲降低、精神沉郁,眼睛和鼻腔有浆液性、粘液性或脓性分泌物,口咽部有水肿或溃疡,流涎,偶尔出现咳嗽和打喷嚏。常见病原主要为猫杯状病毒（FCV）,猫疱疹病毒1型（FHV-I）,支原体（M.felis）,衣原体（C.felis）和支气管败血波氏杆菌（Bb）等。由于
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近年来,随着养猫人群的增加,猫上呼吸道疾病（FURD）因是引起幼猫发病和死亡的重要原因之一而逐渐被关注。FURD典型临床症状主要表现为发烧、食欲降低、精神沉郁,眼睛和鼻腔有浆液性、粘液性或脓性分泌物,口咽部有水肿或溃疡,流涎,偶尔出现咳嗽和打喷嚏。常见病原主要为猫杯状病毒（FCV）,猫疱疹病毒1型（FHV-I）,支原体（M.felis）,衣原体（C.felis）和支气管败血波氏杆菌（Bb）等。由于各种病原引起的临床症状相似,很难通过临床症状进行疾病的区分。本研究拟对引起猫上呼吸道感染的病原:FCV、FHV-1、M.felis及C.felis建立多重PCR检测方法,并根据所建立的方法检测贵阳地区宠物猫上呼吸道感染病原,为临床治疗及合理预防提供指导性作用。1.FCV、FHV-1、M.felis及C.felis四重PCR检测方法的建立通过primer5.0软件,参考NCBI数据库报道的FCV ORF2（登录号:NC001481）、FHV-1 UL26（登录号:NC013590）、M.felis（登录号:NZ＿AP022325.1）和C.felis（登录号:AF269258）等基因序列,设计引物4对,分别用于扩增FCV、FHV-1、M.felis和C.felis目的基因片段。根据已经确诊感染上述4种病原的阳性拭子,提取核酸作为阳性模板,通过对4种病原单一PCR扩增产物的鉴定,并对其退火温度和敏感性进行优化和检测,建立快速检测FCV、FHV-1、M.felis和C.felis的单重PCR检测方法;在所建立的单重PCR检测方法的基础上摸索退火温度、模板及引物的浓度,并对四重PCR进行特异性、敏感性检测,以建立一种能够同时且快速检测FCV、FHV-1、M.felis和C.felis等4种猫常见上呼吸道感染病原的多重PCR检测方法。单一PCR检测方法建立的结果:（1）最佳反应体系:上下游引物各1μL,模板DNA/cDNA 2μL,金牌Mix（green）补足25μL。（2）最佳退火温度:四种病原单重PCR扩增的最佳退火温度范围为50℃～60℃。（3）敏感性结果:各病原基因的最低检测浓度分别为FCV 1×10-5ng/μL、FHV-1 1×10-6ng/μL、M.felis1×10-6ng/μL和C.felis1×10-5ng/μL。四重PCR检测方法建立的结果:（1）最佳反应体系:4对上下游引物各1μL,FCV的cDNA模板1μL,FHV-1、M.felis和C.felis DNA各1μL,金牌Mix（green）补足50μL。（2）最佳退火温度:反应体系最佳退火温度范围为51.7℃-60℃,其中在60℃时所得条带最清晰。（3）敏感性试验:FCV基因的最低检测浓度为1×10-5ng/μL,FHV-1基因的最低检测浓度为1×10-4ng/μL,M.felis目的基因的最低检测浓度为1×10-3ng/μL,C.felis目的基因的最低检测浓度为1×10-4ng/μL。（4）特异性试验:PCR反应管中分别加入患有FCV、FHV-1、M.felis、C.felis病原拭子、健康猫咪拭子、患有猫细小病毒（FPV）的拭子和牛支原体（MB）拭子DNA提取物的反应体系中,分别扩增出FCV、FHV-1、M.felis和C.felis目的基因片段,且未扩增出其他基因片段。2.FCV、FHV-1、M.felis及C.felis四重PCR检测方法的应用用所建立的猫上呼吸道感染四种常见病原的四重PCR检测方法,对2019年10月至2020年9月贵阳某动物医院所接诊的具有上呼吸道感染的患猫的眼结膜、鼻黏膜和口咽黏膜拭子共计170份样本进行检测。检测结果表明:170份临床样本中,有65样本检测到目的基因,检测率38.32%（65/170）,其中单一病原感染34份（20%）,多重病原感染31份（18.23%）。有102份样本未检出目的基因。FCV阳性样本总数33份,阳性率为19.41%（33/170）;FHV-1阳性样本29份,阳性率为17.05%（29/170）;M.felis阳性样本34份,阳性率20%（34/170）;C.felis阳性样本1份,阳性率0.5%（1/170）。本研究所建立的FCV、FHV-1、M.felis及C.felis四重PCR检测方法可应用于相应临床样本的检测,并为病原流行病学调查及后续FCV、FHV-1、M.felis、M.felis和Bb五重PCR检测方法提供参考。
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