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研究目的关节软骨缺乏自我再生和愈合能力,软骨病损后的修复问题仍是临床上的一项重大难题。再生医学的发展带来了治疗软骨病损的希望,在一些国家和地区已经开展使用干细胞修复关节软骨的临床试验。目前这些研究仍处于摸索、试错阶段,为了提高软骨修复效果,众多研究者开始把重心投在能够优化、改善干细胞治疗功能的策略上,包括干细胞的来源、预处理以及辅助材料上。本研究目的旨在评价IPFP-SCs作为干细胞来源用于修复软骨的可行性,并从PRP的优化选择和细胞分离途径两个方面分别进行研究,探讨IPFP-SCs修复关节软骨的方法,为临床应用提供思路和参考。研究内容及结果本实验研究由三部分组成。第一部分,使用酶消化法提取兔IPFP-SCs并进行体外培养、表型鉴定以及三向分化能力检测;使用两次离心法制备含白细胞PRP(L-PRP)与乏白细胞PRP(P-PRP),通过体外实验分析比较两种不同形式PRP对IPFP-SCs的影响,如细胞增殖速率、细胞表型以及基因表达,并检测L-PRP与P-PRP对IPFP-SCs的成软骨能力之间的差异。第二部分,使用无酶非消化的方法分离、提取、培养IPFP-SCs,与传统酶消化法获取的IPFP-SCs在细胞的增殖能力、表征以及三向分化能力上做比较,重点比较两者在成软骨诱导分化方面的差异。第三部分,将24只新西兰大白兔随机分为4组,兔关节软骨缺损造模后关节腔注射不同的制剂,A组无酶法分离的IPFP-SCs与P-PRP混合剂,B组消化法分离的IPFP-SCs与P-PRP混合剂,C组无酶法分离的SVF,D组生理盐水。手术后6周、12周,通过大体观和组织学染色方法观察并评估关节标本软骨修复情况,对比不同的IPFP-SCs应用方式修复软骨缺损的效果。研究结果:1、酶消化的方法分离获得的兔IPFP-SCs经表型鉴定和三向分化能力检测,符合间充质干细胞(MSCs)标准;2、两次离心法制备的L-PRP和P-PRP存在下培养IPFP-SCs,均具有促增殖作用,而且促增殖率表现出与PRP浓度相关。干预培养后,细胞表型的流式检测未见明显差异,P-PRP组细胞COL2、ACAN、SOX9表达要高于L-PRP组及对照组。在软骨球法成软骨诱导培养的结果中,两种PRP干预后的软骨球中COL2、ACAN、SOX9的表达升高,在组织学观察上到更多的蛋白多糖沉积和II型胶原蛋白产生;3、使用无酶非消化法分离获得SVF所需时间要明显少于酶消化的方法,而原代细胞的获得率明显低于酶消化的方法,经培养扩增后的两种不同来源的IPFP-SCs在细胞增殖能力、细胞表型以及三向分化能力上并未表现出明显的差异;4、动物实验中,A、B两组软骨缺损区修复效果最佳,两组间无明显差异,C组修复效果要弱于前两组,但相对优于D组。结论1、IPFP-SCs具有干细胞基本特征,具有成软骨分化潜能。髌下脂肪垫组织可以作为未来再生医学干细胞组织来源,IPFP-SCs未来可能具有良好的应用前景;2、白细胞含量不同的L-PRP和P-PRP均能够促进IPFP-SCs的增殖,但不影响IPFP-SCs的细胞表型,相对L-PRP,P-PRP更有利于促进IPFP-SCs成软骨分化;3、无酶非消化法分离法获取髌下脂肪组织的SVF较酶消化法省时,但获得原代细胞的比率要明显降低;两种分离方法扩增获得的IPFP-SCs在细胞鉴定和三向分化潜能的比较,未见明显差异;4、在兔动物软骨缺损模型中使用无酶法分离的SVF对软骨修复有益,而使用扩增的IPFP-SCs和P-RPP的混合剂的修复效果最佳。