【摘 要】
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猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是目前发现的最小的动物病毒.PCV具有2种基因型:PCV1和PCV2.PCV1和PCV2均可持续感染PK-15细胞,无细胞病变效应(CPE).PCV1无致病性.近年研
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猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是目前发现的最小的动物病毒.PCV具有2种基因型:PCV1和PCV2.PCV1和PCV2均可持续感染PK-15细胞,无细胞病变效应(CPE).PCV1无致病性.近年研究发现PCV2与多种疾病综合征有密切关系,与多种病原体混合感染,并侵害机体的免疫系统,造成的临床症状具有多样性,且病理变化复杂,严重危害猪群健康.确诊PCV2引起的疾病必须满足三个条件:特征性的临床症状,相应的病理变化,病灶中检测到PCV2病原.由于PCV2引起疾病的危害越演越烈,因此迫切需要建立PCV病原学与血清学诊断方法,为疾病诊断与疫苗研究奠定基础.通过比较分析20株PCV1和PCV2核苷酸序列的同源性与差异性,设计合成2对PCV病毒(种)和型特异性引物.P1、P2扩增PCV病毒(种)特异性的938bp片段,可扩增PCV1和PCV2的特异性片段;P3、P4为PCV2型特异性引物,扩增490bp的PCV2特异性片段.应用这两对引物建立猪圆环病毒多重PCR诊断方法,在同一个反应体系中即可对PCV进行检测与定型.对多重PCR的反应条件进行优化,该方法已成功应用到PCV的临床诊断与流行病学调查中.将接种PCV2的用300mM D(+)-氨基葡萄糖处理并经多次传代的PK-15带毒细胞分散到96孔细胞培养板上,制成抗原诊断板,建立猪圆环病毒间接免疫荧光抗体检测技术检测血清中PCV2抗体.对各种反应物的工作浓度与作用时间进行优化,经试验确定,在接毒后24h用300mM D(+)-氨基葡萄糖处理30min,在第二次传代后作第二次处理,以提高病毒感染细胞数量;固定液采用70％丙酮,固定时间为10min;一抗工作浓度为1:20,二抗工作浓度为1:120;一抗和二抗均作用30min.该方法具有良好的特异性和敏感性,不与其它病毒阳性血清反应.该方法可用于PCV2抗体水平监测,为流行病学调查提供方法,为今后疫苗研究所需的抗体检测技术奠定基础.应用上述建立的两种方法进行猪圆环病毒病临床病例的诊断,从有临床症状的猪群中分离到3株2型猪圆环病毒(S2、P11、L).通过设计合成两对可扩增病毒全基因的引物,PCR分别扩增1175bp、989bp的两个片段.
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