目的从脑缺血再灌注后不同时间点大鼠的体重增长率、神经功能缺损、脑梗死体积、脑组织病理改变、微血管形态学、细胞存活以及血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)、血管内皮细胞标志物CD34表达等方面的动态变化,观察大鼠脑缺血再灌注后脑组织损伤以及微血管新生的特点,揭示其变化规律；通过大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)移植、转基因VEGFBMSCs移植、脑脉一号及其联合应用对上述变化的影响,探讨脑脉一号联合干细胞移植对缺血再灌注大鼠的保护作用及脑组织微血管新生的促进作用,初步揭示其可能的作用机制。方法采用雄性SD大鼠,235只,体重250g-330g,随机分组：大鼠根据处理因素分为假手术组和手术组,手术组包括模型组(简称Model组)、骨髓间充质干细胞移植组(简称BMSCs组)、转基因VEGF骨髓间充质干细胞移植组(简称BMSCs/VEGF组)、脑脉一号组(简称NMYH组)、脑脉一号联合BMSCs移植组(简称NMYH+BMSCs组)及脑脉一号联合BMSCs/VEGF移植组(简称NMYH+BMSCs/VEGF组)。假手术为8只,其余各组27只。手术组根据取材时间点不同又随机分为7d、14d、21d组,每组每个时间点分别为8、8、11只。全骨髓贴壁培养法体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,通过形态学观察及表面标记物鉴定细胞。应用细胞标记液氯甲基苯甲酰氨(CM-Dil)标记BMSCs,荧光倒置显微镜下观察其24h、21d和30d的标记情况,描绘生长曲线明确标记物对体外培养BMSCs生长特性的影响。通过阳离子脂质体介导真核表达质粒pEGFP-VEGF,65转染体外培养的BMSCs,荧光显微镜、流式细胞仪、酶联免疫吸附法(ELISA)、RT-PCR方法检测pEGFP-VEGF165目的基因的表达,MTT法检测基因转染对细胞增殖的影响。参照改良的Longa’s建立大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血动物模型(middle cerebral artery occlusion, MCAO),术后2小时缓慢拔出栓线3-4mm进行缺血后再灌注；再灌注后24小时BMSCs组、NMYH+BMSCs组大鼠纹状体通过立体定位仪注以10μl (5×104/ml)BMSCs, BMSCs/VEGF组、和NMYH+BMSCs/VEGF组注以等量转基因VEGF后的BMSCs, Model. NMYH组组注以等体积无血清L-DMEM;移植后NMYH组、NMYH+BMSCs组、NMYH+BMSCs/VEGF组大鼠给予脑脉一号灌胃(1.5g/kg/d),假手术组、Model组、BMSCs组、BMSCs/VEGF组大鼠给予等量的生理盐水。在各取材时间点观察大鼠体重增长率、神经功能评分；TTC染色测定脑梗死体积；光镜下观察缺血区病理改变；激光共聚焦显微镜观察脑缺血边缘区微血管生成情况；脑组织冰冻切片荧光显微镜下观察CM-Dil标记移植细胞；免疫组织化学法检测缺血边缘区VEGF和CD34表达。结果1. BMSCs贴壁培养至第3代后变为形态较均一、排列有序的成纤维细胞样细胞,CD34、CD44和CD29表达率分别为1.71%、92.10%和95.32%。体外CM-Dil标记24h的BMSCs发出红色荧光,标记效率达100%,经过传代培养21d,荧光强度与24h相接近,但30d后荧光有所淬灭。标记后细胞的生长、增殖特性未受影响,形态无改变。2.将pEGFP-VEGF165重组质粒转染体外扩增培养的BMSCs后,荧光显微镜下观察可见绿色荧光,转染率约为14%；RT-PCR检测到hVEGF mRNA基因表达,ELISA测得VEGF蛋白表达水平以第5天时最高。转染后细胞的增殖能力未有改变。3.缺血再灌注术后7d大鼠出现明显的脑梗死,神经细胞严重水肿,部分神经元元发生变性、坏死,形成坏死灶,部分微血管残缺、破损,神经功能缺损症状严重,体重急剧下降,随着时间的推移,病理损伤程度有所减轻。BMSCs移植组、BMSCs/VEGF移植组、NMYH组及NMYH联合移植组分别较模型组脑梗死体积减少,病理组织受损程度减轻,神经功能缺损减轻,体重增加率明显增加,其中以联合组NMYH+BMSCs/VEGF效果最佳,但其联合效应与NMYH组没有显著差异。与非缺血侧相比,缺血侧脑组织微血管出现不规则的迂曲形状,可见FITC-Dextran渗透到血管周围组织。与模型组比较,BMSCs移植组、BMSCs/VEGF移植组、NMYH组均能增加缺血组织微血管面积,但差异无显著性意义,联合组NMYH+BMSCs、NMYH+BMSCs/VEGF较模型组能显著提高微血管面积。荧光显微镜下可见BMSCs移植后7d发出红色荧光,主要位于针道附近,多为梭形。随着植入时间的延长,BMSCs逐渐减少,迁移范围逐渐扩大,且趋向于缺血周边区,主要呈椭圆形或不规则形。与NMYH联合后,脑内BMSCs存活数量明显增多。BMSCs移植组、BMSCs/VEGF移植组、NMYH组对VEGF表达均较模型组显著。联合组NMYH+BMSCs、NMYH+BMSCs/VEGF能显著提高VEGF表达,且其联合作用较各单独用药组显著增加。BMSCs移植组、BMSCs/VEGF移植组、NMYH组对CD34表达均较模型组显著。联合组NMYH+BMSCs、NMYH+BMSCs/VEGF能显著提高CD34表达,且其联合作用较各单独用药组显著增加。结论1.通过贴壁培养可以从大鼠骨髓中分离培养出较纯的BMSCs。CM-Dil染色简单、方便、有效、且无细胞毒性,体外标记BMSCs最短时限为21d,可用于BMSCs定向移植的脑内示踪。2.成功将pEGFP-VEGF165重组质粒转染BMSCs。3.脑缺血再灌注后可导致大鼠脑组织明显的病理损伤,BMSCs移植组、BMSCs/VEGF移植组、NMYH组及NMYH联合移植组均可抗脑缺血损伤,改善脑缺血大鼠神经功能,以联合组NMYH+BMSCs/VEGF效果最佳。促微血管再生可能是其脑保护机制之一；BMSCs移植后能在脑组织内存活,分化,并向缺血区迁移,VEGF基因修饰后BMSCs移植存活率未见改变,而脑脉一号能增加移植细胞区域的血供,减少脑梗死体积,故与其联合用药时,可促进BMSCs移植后在脑组织内的存活及向血管内皮细胞分化,从而促进微血管生成。促血管新生的机制可能与其上调VEGF的表达有关。