目的:1、筛选合适的致孔剂,在高压静电喷球技术的基础上建立一种绿色的方法制备多孔丝素微球,并评估其可行性。2、评估丝素-葡萄糖微球和丝素微球的理化性质、孔隙结构特点,分析调控丝素-葡萄糖微球孔隙结构的因素。3、探讨多孔丝素微球作为载体对负载细胞行为、药物释放行为的影响。4、探讨微球多孔结构对体内埋植微球诱导细胞和组织长入、调控初期免疫炎症反应和血管化形成及调控纤维包裹厚度等的影响。方法:1、选取多种水溶性致孔剂分别加入丝素溶液,利用高压静电喷球技术制备微球将微球置于-20℃环境中冻存后冷冻干燥,在扫描电子显微镜下观察微球孔隙结构,筛选合适的致孔剂。2、通过体式显微镜和扫描电子显微镜分别观察微球的大体球形结构和孔隙结构;通过光学显微镜下的明场图片并使用imageJ软件计算微球的孔隙率;借助考马斯亮蓝快速蛋白定量法测定微球在液体环境中的侵蚀率;通过调控制球参数、冻存时间、丝素浓度以及葡萄糖含量等,观察丝素-葡萄糖微球大小及孔隙结构的可控性。3、在丝素微球和丝素-葡萄糖微球上种植大鼠骨髓间充质干细胞,并利用CCK-8检测试剂盒、Live/Dead染色、鬼笔环肽染色等观察细胞在微球上的粘附、增殖、伸展等行为,从而探讨微球孔隙结构对细胞行为的影响。4、添加BSA和RhB两种模式药物的微球在PBS中持续释放一周并检测药物释放量,观察微球孔隙结构对药物释放行为的影响。5、将微球注射种植于大鼠背部皮下,通过HE染色和免疫荧光染色观察组织、宿主细胞迁移、初期炎症反应、新生血管长入及纤维化程度等,评估丝素微球和丝素-葡萄糖微球与周围组织的整合情况。结果:1、加入葡萄糖、蔗糖、甘露糖、木糖醇四种致孔剂的丝素微球具备孔隙结构,其中丝素-葡萄糖微球的孔径较大且均一,且葡萄糖作为能量来源被生物体吸收利用,故最终选定葡萄糖为致孔剂参与后续研究。2、丝素微球及丝素-葡萄糖微球外观均呈大小均一的球形,丝素微球表面多有裂隙,而丝素-葡萄糖微球球形结构完整;丝素微球内部结构致密,而丝素-葡萄糖微球内部孔隙密集,孔隙间相互连通;丝素微球孔隙率仅为12.45%,丝素-葡萄糖微球孔隙率为64.87%;丝素微球及丝素-葡萄糖微球在液体环境中结构稳定,一周内侵蚀率增加均不超过1%。3、通过改变高压静电喷球过程中的喷头尺寸及溶液流速,实现了在50-550μm范围内调控微尺寸,且微球尺寸均一性良好;丝素-葡萄糖微球在-20℃环境中冻存出现孔隙,且一定时间范围内随着冻存时间延长,孔径及孔隙率增加;增加葡萄糖含量在一定范围内增加孔径,继续增加葡萄糖含量则导致微球难以维持自身结构,微球轮廓塌陷或皱缩,反之,增加丝素含量微球结构维持良好,但是孔径相对减小。4、种植在丝素微球及丝素-葡萄糖微球上的大鼠骨髓间充质干细胞均有增殖,然而种植在丝素-葡萄糖微球上的细胞增殖速度更快,趋势更明显;细胞在丝素-葡萄糖微球上粘附更为紧密,而丝素微球上的细胞随着培养时间延长逐渐脱落;细胞通过丝素-葡萄糖微球内外连通的孔隙结构相互接触联系,而细胞在丝素微球表面孤立地铺展伸开,不与周围细胞发生联系。5、模式药物的表面电荷影响药物在微球上的释放效率,由于电荷间的作用,带表面负电荷的BSA在表面电荷为负丝素微球和丝素-葡萄糖释放效率分别低于表面电荷为正电荷的RhB在相应微球上的释放效率,累积释放量较低。多孔结构同样影响模式药物的释放行为,药物在多孔丝素-葡萄糖微球上累积释放量更多,而在丝素微球上释放效率较低。6、丝素微球和丝素-葡萄糖微球植入大鼠皮下后,宿主细胞、组织向丝素-葡萄糖微球内部迁移,而几乎不向丝素微球内部长入;微球植入一周内,丝素-葡萄糖微球内部有多量M2型巨噬细胞,少量M1型巨噬细胞,而丝素微球内部两类巨噬细胞均较少;新生血管向丝素-葡萄糖微球内部长入,而仅分布于丝素微球周围;丝素微球周围有较厚的纤维组织,而丝素-葡萄糖微球周围纤维化不明显。结论:1、加入葡萄糖后经高压静电喷球技术制备的丝素-葡萄糖微球内外出现高度开放的孔隙结构,孔隙相互连通,孔径较大且均一性较好,此外,丝素-葡萄糖微球维持了规则的球形结构,在液体环境中能保持结构稳定。2、微球尺寸通过调控高压静电喷球参数控制,孔隙结构可以通过调控冻存温度、时间以及调控丝素和葡萄糖含量来控制,实现对多孔丝素微球孔隙结构的精细调控。3、丝素-葡萄糖微球的多孔结构促进了细胞更好的粘附、增殖及相互联系,构建了 3D的细胞培养模式4、丝素-葡萄糖微球的多孔结构使药物释放效率更高,累计释放量和释放速率都更明显;药物的表面电荷也影响释放行为,表面电荷为负电荷的药物释放率更明显;表面电荷为正电荷的药物释放较缓慢。5、丝素-葡萄糖微球的多孔结构诱导宿主细胞向微球内迁移长入,且多孔结构具有调控微球植入后的初期炎症反应和血管化形成以及纤维包裹的作用。