论文部分内容阅读
甘蓝型油菜（Brassica napus L．）是世界四大油料作物之一，也是我国重最要的油料作物之一。黄籽油菜近年颇受重视，与黑籽油菜相比，具有种皮色素少、种皮薄、纤维素含量低以及蛋白质和含油量高的优点，培育遗传稳定、农艺性状优良的黄籽甘蓝型油菜已成为油菜育种的一个重要目标之一。甘蓝型油菜黄籽性状形成的分子机理目前还不清楚，但可以借鉴拟南芥透明种皮（Transparent testa，TT）性状研究成果，开展甘蓝型油菜种皮色泽分子机制的研究。目前在拟南芥中已鉴定出21个TT基因位点和一个BAN位点，并且许多TT基因在拟南芥中已经被克隆。拟南芥TT8（AtTT8）是类黄酮合成途径中的一个调控因子，它属于碱性螺旋-环-螺旋（basic-Helix-loop-helix domain，bHLH）转录因子，此类转录因子在生物的发育过程中具有重要作用，拟南芥、玉米、矮牵牛、金鱼草等植物中该基因的突变导致种子颜色或花色改变。拟南芥中，TT8、TTG1、TT2三个蛋白都调控BAN基因和DFR基因的转录。研究油菜TT8基因有助于进一步了解甘蓝型油菜黄籽性状形成的分子机制，可以为通过基因工程创造稳定的黄籽甘蓝型油菜新材料提供基础。本研究克隆了甘蓝型油菜TT8基因家族的3个成员的全长cDNA和1个成员的基因组序列，并对其序列及编码蛋白进行了系统的分析；通过Sourthern杂交鉴定了TT8基因家族在甘蓝型油菜中的成员数；构建了甘蓝型油菜TT8基因家族反义植物表达载体，并转化黑籽甘蓝型油菜得到了转基因植株。主要结果如下：1、甘蓝型油菜BnTT8基因家族3个成员的克隆和分析根据AtTT8保守区设计引物，以甘蓝型油菜黑籽系5B生殖器官总RNA为材料，利用RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术，克隆了BnTT8基因家族的3个成员的全长cDNA序列，分别命名为BnTT8-1、BnTT8-2、BnTT8-3，并克隆了BnTT8-1的基因组序列。BnTT8-1基因组序列长2949bp，含6个内含子，mRNA（不包括polyA，下同）为1771bp，开放阅读框（ORF，包括终止密码子，下同）为1566bp，5’UTR为147bp，3’UTR为58bp。BnTT8-2mRNA为1783bp，ORF为1566bp，5’UTR为137bp，3’UTR为80bp。BnTT8-3 mRNA为1676bp，的ORF为1308bp，5’UTR为134bp，3’UTR为231bp。在BnTT8-1、BnTT8-2和BnTT8-3在3’UTR均存在典型的AATAAA加尾信号，在5’UTR区都有富含AG重复的微卫星序列。核苷酸组成在不同区段变化较大，非编码区G+C含量明显低于编码区。BnTT8-1的内含子的总长度比拟南芥大大缩短。推导的BnTT8-1蛋白为521个氨基酸，Mw=59.669kDa，pI=5.61；BnTT8-2为1个521个氨基酸，Mw=59.955kDa，pI=5.65；BnTT8-3为435个氨基酸，Mw=50.071kDa，pI=5.47。3个蛋白中均以谷氨酸的含量为最高，且酸性氨基酸数目多于碱性的氨基酸。BnTT8-3 mRNA对应于其它TT8基因的终止密码子发生突变，且与其它TT8 mRNA相比在该位置上游发生了一段107bp的序列缺失，导致编码的蛋白比其它TT8蛋白在C-末端缺少86个氨基酸。BnTT8-1、BnTT8-2和BnTT8-3之间在氨基酸水平上有很高的同源性，BnTT8-1和BnTT8-2的一致性和相似性分别为96.7％和98.1％，BnTT8-1和BnTT8-3的一致性和相似性分别为97％和98.6％，BnTT8-2和BnTT8-3的一致性和相似性分别为98.4％和99.3％。BnTT8基因的核酸及蛋白序列与已知植物的TT8基因和bHLH基因的核酸及蛋白序列有高度的同源性，尤与AtTT8最相似。BnTT8-1与AtTT8的相似性为83.4％，一致性为76.5％；BnTT8-2与AtTT8的相似性为83.9％，一致性为76.9％；BnTT8-3与AtTT8的相似性为83.9％，一致性为77.5％。BnTT8-1、BnTT8-2和BnTT8-3蛋白都在L366到H417区域分别对应存在HLH保守性结构域，在该结构域及保守性氨基酸位置，它们与AtTT8高度相似。它们分别有33个、33个和32个潜在的磷酸化位点，说明磷酸化作用可能与它们的活性有关。它们的二级结构主要由a螺旋和随机卷曲组成，延伸链和β转角也占一定比例。BnTT8家族3个成员可能和AtTT8一样，调控类黄酮途径的结构基因表达。由于BnTT8-3蛋白的C-末端缺失了86个氨基酸，所以该成员蛋白是否具有活性，活性强弱如何，值得进一步研究。2、甘蓝型油菜BnTT8基因家族的成员数Southern blot杂交结果中，每种限制酶均获得3条或3条以下的杂交条带。而本研究采用竭尽式RACE克隆方式，也只获得了3个成员的全长cDNA。因此推测，甘蓝型油菜中BnTT8基因家族可能只存在3个成员。3、BnTT8反义表达载体的构建将BnTT8基因家族共保守的817bp的片段反接到中间表达载体pCambia2301G中，替换其上的GUS基因，形成CaMV 35S启动子驱动、反义共抑制所有BnTT8成员的植物表达载体，命名为pFBnTT8A。4、甘蓝型油菜TT8反义转化植株的获得采用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜“湘油15”，获得了24株抗卡那霉素的再生苗，通过检测GUS基因在抗性植株中的稳定表达情况，发现其中13株为稳定表达的转基因植株，转化频率达到2.23％。