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日本沼虾(Macrobrachium nipponense,俗称河虾或青虾)是一种重要的淡水养殖虾类,其味道鲜美,营养价值很高,可创造极大的经济价值。但随着日本沼虾养殖业的发展,养殖水域环境的复杂化,日本沼虾的养殖遭受着疾病的困扰,因此预防虾类病害,研究其先天免疫防御机制刻不容缓。纤维胶凝蛋白(ficolin)在识别和清除先天免疫中的病原体方面具有关键作用。Tolls在对抗病原侵染的先天免疫应答中发挥重要作用。免疫缺陷(IMD)信号途径介导甲壳动物对革兰氏阴性菌的先天免疫。本论文以日本沼虾为研究对象,研究ficolin-like蛋白、Toll和IMD信号通路关键因子在其免疫系统中的作用。1.两种ficolin-like蛋白在先天免疫防御中的作用在这项研究中,我们鉴定了来自日本沼虾的两个ficolin-like基因。这两种基因被命名为MnFico1和MnFico2。MnFicol的cDNA全长有1600bp,而MnFico2有1486bp。除了卷曲螺旋区域或低复杂度区域之外,这两种ficolins都含有信号肽和纤维蛋白原样结构域(FReD)。qRT-PCR结果表明MnFico1在鳃中表达量最高,而MnFico2在心脏中表达量最高。MnFico1和MnFico2的转录本都可以对细菌刺激作出反应。利用RNA干扰技术将MnFico1或MnFico2敲低后,抗脂多糖因子ALFs(MnALF1和MnAL 2 和甲壳肽crusti 基因(MnCru4,MnCru5,MnCru6和MnCru7)的转录在副溶血弧菌刺激后的24 h明显受到抑制。重组蛋白rMnFico1和rMnFico2可以与不同的细菌结合,并在存在钙离子(Ca2 +)的情况下凝集革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。rMnFico1和rMnFico2蛋白也具有脂多糖和肽聚糖结合活性。这两种重组ficolin蛋白都可以在日本沼虾体内帮助清除副溶血弧菌。我们的研究结果表明,MnFico1和MnFico2可能作为模式识别受体在日本沼虾对抗细菌入侵的先天免疫防御中发挥重要作用。2.Toll受体在鳃中调节抗菌肽(AMP)的表达在这项研究中,一种新的Toll基因MnToll1首先从淡水虾日本沼虾中被鉴定出来。MnToll1cDNA全长3186bp,包含2867bp的开放阅读框,编码含955个氨基酸残基的蛋白质。MnTollU包含1个信号肽,12个LRR结构域,3个LRR_TYP结构域,2个LRR CT结构域,1个低复杂度结构域,1个跨膜区结构域和1个TIR结构域。qRT-PCR分析表明,MnToll1广泛表达于所有被测试的组织。并且在副溶血弧菌刺激后,鳃中MnToll1的表达显著上调。dsRNA干扰的结果显示,MnToll1能够调节日本沼虾鳃中2种甲壳肽Crustins(MnCru4和MnCru6)的表达。此项研究表明日本沼虾MnToll1在诱导抗菌肽表达的先天性免疫应答中具有重要作用。3.免疫缺陷同系物(IMD)在先天免疫中的作用在本研究中,我们在日本沼虾中鉴定了一个IMD受体(MnlMD)。MnIMD的全长cDNA为782bp,开放阅读框为549bp,编码一个含182个氨基酸的蛋白质,在C末端的一个死亡结构域。多序列分析显示,日本沼虾和其他甲壳类动物中的IMD具有很高的相似性,并且系统发育树的同一分支。对MnIMD重组蛋白进行表达和纯化并制备抗血清。运用该抗血清进行Western印迹分析,结果显示MnIMD存在于大多数组织中,且在鳃中的表达量最高,这与qRT-PCR结果一致。副溶血弧菌刺激后,鳃中MnIMD基因的表达显著上调。dsRNA干扰实验结果表明IMD途径参与调控不同抗菌肽(AMP)基因(Cru4和Cru6)的表达。综上所述,对ficolin-like、Toll以及IMD等免疫基因的研究有助于加深对日本沼虾先天免疫机制的认识,同时也对虾类病害防治具有理论指导和现实应用意义。上述实验结果有助于我们促进对日本沼虾先天免疫的研究。