目的:将潜伏期细菌表达的优势抗原与生长期细菌的优势抗原结合,有助于开发保护效果更好的新型结核亚单位疫苗。本试验拟筛选免疫原性较强的结核分枝杆菌潜伏期抗原,制备含结核菌潜伏期抗原的新型治疗性融合蛋白疫苗。进一步建立小鼠肺部卡介苗(BCG)潜伏感染模型,并用该模型对新构建的融合蛋白疫苗的治疗作用进行初步评价。方法:1)在大肠埃希菌中克隆表达前期利用生物信息学方法筛选出的HspX、Rv1738、Rv2626c、Rv2007c和Rv3130c五个与结核潜伏感染相关抗原,检测它们在结核病患者、密切接触者和健康大学生志愿者中体液免疫和细胞免疫特征,评价上述抗原的免疫原性,筛选出免疫原性最强的抗原。2)通过基因工程技术,构建融合蛋白pET30a-ESAT6-Rv1738-Rv2626c(LT40)和pET30a-CFP10-HspX(LT28),然后在大肠埃希菌中表达、得到相应的蛋白。3)在小鼠模型上检测融合蛋白LT40的免疫原性,即在第0、3、6周分别用蛋白LT40、ESAT6、Rv1738和Rv2626c免疫小鼠三次,末次免疫后6周检测小鼠结核抗原的特异性抗体水平及脾细胞在结核抗原刺激下细胞因子IFN-γ的分泌情况。4)用牛分枝杆菌减毒株卡介苗(BCG)5×106CFU通过滴鼻的方法造成小鼠肺部感染,感染后2天、4周、8周和12周行肺部结核菌落计数,并肌肉注射地塞米松以降低小鼠的免疫力,连续干预3周后隔一周进行菌落计数。地塞米松干预后检测小鼠肺部BCG的细菌载量,来确定潜伏感染模型是否建成。即当小鼠肺部组织培养不出分枝杆菌,但经地塞米松免疫干预后,从肺脏组织中培养出了大量的分枝杆菌时,该模型成功建成。5)利用建立的小鼠肺部BCG潜伏感染模型来评价融合蛋白疫苗的治疗作用,使用的融合蛋白包括:ESAT6-Ag85B-MPT64<190-198>-Mtb8.4-Rv2626c(LT70)和LT40,我们实验室已经证实LT70对感染结核菌的小鼠具有较强的免疫保护力。小鼠感染BCG后随机分为五组:PBS组、佐剂组、LT40组、LT70组和LT40+LT70组。疫苗组小鼠分别于第12、14和16周用腹股沟皮下注射的方法进行疫苗治疗干预,生理盐水组和佐剂组小鼠同样注射生理盐水和佐剂作为对照。所有小鼠分别于第20、21和22周用肌肉注射地塞米松的方法进行免疫干预,在第25周用颈椎脱臼的方法处死小鼠,进行肺脏组织的分离与解剖和眼球取血,将肺脏组织研磨后进行bcg菌落计数。结果:1.人群试验结果表明,在5个结核菌潜伏期高表达的抗原hspx、rv2626c、rv2007c、rv1738和rv3130c中,在不同人群中抗原的免疫原性强弱依次是rv1738、rv2626c、rv3130c、hspx和rv2007c。这些抗原的免疫原性在结核病密切接触者中均高于健康大学生志愿者和结核病患者。相反,在结核病患者人群中,结核生长早期分泌性抗原esat6和cfp10引起ifn-γ的分泌水平却高于健康大学生志愿者。我们推测抗原rv1738、rv2626c、rv3130c在保护机体免受结核分枝杆菌侵害过程中起了不同程度的保护作用,其中在潜伏感染人群中,rv1738抗原引起的细胞免疫和体液免疫应答最强,是结核菌潜伏期的一个保护性抗原。2.串联结核杆菌生长期抗原esat6、潜伏期抗原rv1738和rv2626c构建融合蛋白疫苗lt40,发现其以包涵体的形式在大肠埃希菌中稳定表达,得到较高纯度的蛋白;连接结核杆菌生长期抗原cfp10和潜伏期抗原hspx构建的融合蛋白lt28在大肠埃希菌中表达量低,未纯化出相应蛋白。3.小鼠免疫实验表明:lt40蛋白可诱导lt40抗原免疫过的小鼠血清中产生特异性抗体igg1和igg2c,可刺激lt40抗原免疫过的小鼠脾淋巴细胞分泌较高水平的ifn-γ,而单个抗原刺激产生免疫反应较弱,提示融合蛋白lt40诱导的免疫应答与天然抗原有所不同。4.成功建立小鼠肺部bcg潜伏感染模型。以滴鼻的方式使小鼠肺部感染bcg,12周后小鼠肺部组织培养不出分枝杆菌,但经地塞米松免疫干预后分枝杆菌大量暴发,从肺脏组织中培养出了大量的分枝杆菌。5.利用建立的小鼠肺部bcg潜伏感染模型来评价蛋白疫苗的治疗作用,结果示:相比其他组,pbs组结核菌载量较高,说明有大量的分枝杆菌在免疫抑制后暴发;相比pbs组,疫苗治疗组和佐剂组的结核菌载量均较低,而疫苗治疗组(lt40组、lt70组和lt40+lt70组)的结核菌载量最低。说明lt40蛋白和lt70蛋白对小鼠肺部潜伏感染的bcg有一定的清除作用。结论:1.在与结核潜伏感染相关的抗原(hspx、rv2626c、rv2007c、rv1738和rv3130c)中,rv1738抗原引起的细胞免疫和体液免疫应答最强,是结核菌潜伏期的一个保护性抗原。6.成功构建融合蛋白疫苗lt40,其以包涵体的形式在大肠埃希菌中稳定表达,得到较高纯度的蛋白;LT40蛋白可诱导LT40抗原免疫过的小鼠血清中产生特异性抗体IgG1和IgG2c,可刺激LT40抗原免疫过的小鼠脾淋巴细胞分泌较高水平的IFN-γ,而单个抗原刺激产生免疫反应较弱,提示融合蛋白LT40诱导的免疫应答与天然抗原有所不同。2.成功建立小鼠肺部BCG潜伏感染模型,为结核蛋白疫苗的治疗效果评价提供了一个简单易行的模型。3.融合蛋白LT40和LT70对小鼠肺部潜伏感染的BCG有一定的清除作用。