子痫前期患者CACNA1D基因突变对血管内皮细胞Cav1.3和ET-1表达的影响

来源 :福建医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:blackboy1221
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目的:研究子痫前期患者CACNA1D基因突变对血管内皮细胞Cav1.3蛋白和ET-1表达的影响,探索子痫前期发病原因,以寻求新的监测手段及干预靶点,为预防和治疗提供新的思路。方法:(1)取得健康产妇分娩的新生儿脐带,采用胶原酶灌注消化法,从中分离人脐静脉内皮细胞,进行培养观察;运用细胞免疫荧光技术,根据内皮细胞特异性表达血管性血友病因子,对细胞进行标记鉴定,确保后续研究对象为内皮细胞。(2)扩增CACNA1D基因的c DNA序列,经过内切酶剪切后,由连接酶连至pc DNA3.1(+)载体;转化连接产物,挑出克隆,扩大培养,少量提取质粒,行DNA测序鉴定,同时合成分别具有CACNA1D基因c.A920G,c.G1345A,c.A1697G,c.G2242A,c.G2689A,c.C3914T,c.G4475A这7个突变位点的pc DNA3.1(+)-CACNA1D载体,并经DNA测序鉴定,确保合格的质粒载体用于后续实验。(3)将构建好的携带有CACNA1D基因野生型和上述7个突变位点的pc DNA3.1(+)-CACNA1D载体,运用脂质体转染法,分别转染至内皮细胞;通过Western blot研究CACNA1D基因突变对该基因编码的Cav1.3蛋白表达的影响,接着选取与野生型相比Cav1.3蛋白表达具有阳性差异的突变位点,通过Western blot和RT-qPCR研究CACNA1D基因突变对内皮细胞ET-1 mRNA和蛋白表达的影响。结果:(1)成功分离人脐静脉内皮细胞,并完成鉴定,可用于后续实验研究。(2)成功构建pc DNA3.1(+)目的基因载体,分别携带有CACNA1D野生型基因,以及CACNA1D c.A920G,c.G1345A,c.A1697G,c.G2242A,c.G2689A,c.C3914T,c.G4475A突变型基因,均测序鉴定正确,可用于后续实验研究。(3)上述真核表达载体均成功转染至内皮细胞,并表达相应的Cav1.3蛋白;其中与野生型相比,可引起内皮细胞Cav1.3蛋白表达增加的有c.A920G(P=0.0325),c.G1345A(P=0.0309),c.G2242A(P=0.0356),c.G2689A(P=0.0432),c.G4475A(P=0.0419);然后将这5个突变型与野生型相比,均可引起内皮细胞ET-1 mRNA表达的增加c.A920G(P=0.0452),c.G1345A(P=0.0162),c.G2242A(P=0.0460),c.G2689A(P=0.0146),c.G4475A(P=0.0311);同样与野生型相比,亦可引起内皮细胞ET-1蛋白表达的增加c.A920G(P=0.0143),c.G1345A(P=0.0115),c.G2242A(P=0.0359),c.G2689A(P=0.0299),c.G4475A(P=0.0235)。结论:(1)成功分离获取并鉴定人脐静脉内皮细胞。(2)pc DNA3.1(+)-CACNA1D载体构建成功。(3)子痫前期患者CACNA1D基因c.A920G,c.G1345A,c.G2242A,c.G2689A,c.G4475A突变可引起内皮细胞Cav1.3蛋白、ET-1 mRNA和蛋白表达的增加。
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