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目的:泛素化修饰是细胞内蛋白质共价修饰的主要类型之一,通过调节蛋白质稳定性、蛋白质定位和信号传递等过程参与了细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移等几乎一切生命活动。与磷酸化、甲基化和乙酰化类似,蛋白质的泛素化也是一个可逆的反应。细胞内存在一个庞大的去泛素化酶家族(deubiquitinases,DUBs)可以去除蛋白质的泛素化。USP9X(在鼠中称FAM)是最大的泛素特异性蛋白酶家族(ubiquitin-specific protease)的一员。X染色体偶联的去泛素化酶USP9X通过靶向不同底物,调节多种细胞活动,包括内吞、凋亡、生长和迁移、免疫应答以及自噬等。除此之外,USP9X异常与一些病理状态有关,包括伴X染色体的智力缺陷以及各种类型的恶性肿瘤。但是USP9X参与乳腺等肿瘤发生与发展的机制尚需要进一步研究。与染色体相似,中心体在每一个细胞周期中有且仅有一次精确复制,其异常扩增可以形成两个以上的中心体和纺锤体、严重扰乱有丝分裂和细胞质分裂过程,进而导致染色体分离错误和基因组不稳定、促进肿瘤的发生发展。但是,中心体复制调节的分子机制以及中心体扩增是如何被引发从而影响肿瘤的发生发展,尚未研究清楚。为了深入探索蛋白质去泛素化酶USP9X在乳腺发生发展中的作用和分子机制,我们利用免疫亲和纯化、质谱分析、免疫荧光染色和裸鼠成瘤等一系列实验方法展开了研究。初步揭示了USP9X调节中心体的复制和乳腺癌发生发展的分子机理。结果:1、USP9X与CEP131物理上相互作用。去泛素化酶USP9X与中心体蛋白CEP131在多种肿瘤细胞中具有较强的相互作用,USP9X中间的不含明显结构域的区域以及CEP131的N端的第一个螺旋-螺旋结构域是二者相互作用所依赖的结构域。2、USP9X与CEP131共同定位于中心体。免疫荧光染色发现,在细胞周期的S/G2期,USP9X和中心体标志物γ-tubulin、Centrin、中心体蛋白PCM1和CEP131存在明显共定位,提示USP9X是中心体的一个组分,进一步发现USP9X是依赖于CEP131定位于中心体上。3、USP9X能够稳定CEP131的蛋白水平。采用蛋白酶体抑制剂以及半衰期等实验证明CEP131是USP9X的一个底物,USP9X能在蛋白质水平上稳定CEP131,进一步发现USP9X影响CEP131在中心体定上的表达水平。4、USP9X能够去掉CEP131蛋白的泛素链。USP9X能够通过其自身的去泛素化酶活性,催化去除CEP131上多聚泛素链,尤其是K48依赖的泛素链形式,抑制CEP131通过泛素-蛋白酶体途径发生降解,从而稳定CEP131的蛋白水平,充分说明CEP131是USP9X的一个底物作用蛋白。5、USP9X依赖其去泛素化酶活性稳定中心体蛋白CEP131,进而通过影响中心体复制重要因子CDK2的募集调节中心体的复制。USP9X或CEP131过表达后中心体异常扩增、有丝分裂异常,染色体和基因组的不稳定性增加,挽救实验进一步证实了以上观测。6、USP9X与CEP131在多种乳腺癌组织中高表达,且二者的表达水平呈正相关并与乳腺癌恶性程度呈正相关。裸鼠成瘤以及克隆形成实验证明USP9X通过稳定CEP131来调节中心体的异常扩增,进而促进乳腺癌的发生发展。7、为了更好的理解USP9X促进乳腺癌发生发展的分子机理,我们通过SILAC-泛素化组学鉴定了USP9X其它底物,并进行了初步验证。结论:综上所述,本课题发现蛋白质去泛素化酶USP9X和中心体蛋白CEP131在体内、体外有特异的相互作用。USP9X依赖其去泛素化酶活性稳定中心体蛋白CEP131,进而通过影响中心体复制重要因子CDK2的募集来调节中心体的复制;在临床组织样本分析中,我们发现USP9X与CEP131在乳腺癌中高表达,且二者的表达水平呈正相关并与乳腺癌分级呈正相关;USP9X介导的CEP131稳定性调控异常,可以导致中心体的异常扩增、有丝分裂异常、基因组的不稳定性增加,进而促进乳腺癌的发生发展。为了更好的理解USP9X促进乳腺癌发生发展的分子机理,我们通过SILAC-泛素化组学鉴定了USP9X的其它底物,并进行了初步验证和探索。该研究所发现的去泛素化酶USP9X的中心体定位不仅拓展了我们对USP9X的空间分布和分子功能的认识,有助于理解中心体发生和基因组稳定性维持的分子机理,并且提示USP9X可能成为乳腺癌治疗的潜在干预靶点。