论文部分内容阅读
基于纳米载体系统的Cas9/sgRNA复合体直接递送对CRISPR基因编辑和多种遗传疾病的精确治疗都有着非常重大的意义。在本硕士论文工作中,我们开发了一种基于DNA纳米载体的miRNA响应Cas9/sgRNA复合体纳米递送平台,用于特异靶向肿瘤细胞的基因编辑系统递送,可以实现直接针对细胞质的Cas9/sgRNA复合体高效递送和增强的基因编辑效果。具有高度生物相容性的DNA纳米载体可以通过与sgRNA序列杂交的方式有效负载Cas9/sgRNA复合体。更重要的是,通过可编程的序列设计和基于支点(toehold)介导的链置换过程,纳米花上的Cas9/sgRNA复合体可被肿瘤细胞特异高表达的miRNA取代,从而实现Cas9/sgRNA的肿瘤细胞特异性释放。基于这一理念,本课题构建了一种基于DNA纳米花的miR-21响应Cas9/sgRNA复合体递送系统。通过滚环扩增方法合成的DNA纳米花(DNF)具备序列可编程性,良好的生物相容性和生理条件下的可降解性等特点。由于其易于编程的序列设计性,我们在纳米花的序列结构上设计了特异靶向肿瘤细胞表面蛋白MUCl的核酸适配体,可以在复杂的生物环境准确地识别目标,以实现纳米载体对肿瘤细胞的特异靶向。通过设计可与miR-21杂交的的重复序列,结合茎环结构改造的sgRNA(茎环结构上具有与miR-21部分相同的序列),通过序列杂交将Cas9/sgRNA加载到 DNF,组装为DNF/MUC1/Cas9/sgRNA纳米制剂。在实际的递送过程中,该纳米制剂通过MUC1介导的细胞内吞作用进入细胞内部的溶酶体,并通过纳米花在酸性条件下崩解造成的Mg2+大量释放诱导的内体/溶酶体逃逸,直接将Cas9/sgRNA复合体递送至细胞质。此后,细胞质中的miR-21将通过toehold介导的序列置换反应取代DNF上结合的Cas9/sgRNA复合体。由于Cas9蛋白上具有核定位信号(NLS)肽,释放的Cas9/sgRNA复合体可以高效进入细胞核,并通过靶向特定基因的编码区,进行基因编辑抑制相关基因的表达。我们已在细胞实验和动物实验中证实,与无响应释放的对照组相比,基于DNA纳米花的miRNA响应纳米载体可以显著提高递送的Cas9/sgRNA复合体对基因编辑的效率。这一策略的提出了为刺激响应型Cas9/sgRNA纳米递送体系的设计和提高CRISPR系统在体内的基因编辑效果提供了新的思路和方法。