在哺乳动物转基因研究中,乳腺生物反应器因其具有产量高、易收集、表达产物不进入动物体循环系统等优点,被用于制备蛋白的研究,部分乳腺生物反应器已经进入商业化生产阶段。如何进一步提高乳腺生物反应器的表达效率和表达产物活性成为了人们研究的重点。本实验选用具有新霉素抗性基因neorr表达框架的Plasmid GFP-PGK-Neor质粒为骨架,构建了14kb的乳腺组织特异性表达人凝血因子Ⅸ(hFIX)的同源打靶载体。通过PCR方法分别扩增奶山羊β—酪蛋白基因5’同源臂,人凝血因子Ⅸ基因,bGH PolyA序列,奶山羊β—酪蛋白基因3’及3’同源臂,并顺序定向克隆于真核表达质粒Plasmid GFP-PGK-Neor的多克隆位点。成功构建以奶山羊β—酪蛋白基因上下游为同源臂,由奶山羊β-casein基因5’端上游序列调控hFIX基因转录,bGH polyA序列为转录终止信号的组织特异性表达载体。经限制性酶切片段分析及DNA序列测序验证,结果表明,所构建载体结构正确。将构建的表达载体通过电转染法导入奶山羊成纤维细胞和奶山羊乳腺上皮细胞,经G418筛选后获得稳定的转基因细胞,提取细胞基因组DNA进行PCR鉴定,确定所转染的奶山羊成纤维细胞和乳腺上皮细胞内含有转入目的基因的阳性细胞。本实验所获得的转基因细胞为进一步在细胞水平检测外源基因的表达,及为通过体细胞核移植方法获得乳腺特异性表达人凝血因子Ⅸ的转基因羊奠定了实验基础。