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血清1型马立克氏病病毒(Marek’s disease virus serotype 1,MDV-1)是致瘤性α-疱疹病毒,在鸡群中可引起以致死性T细胞淋巴瘤为特征的马立克氏病(Marek’s disease,MD)。虽然通过免疫接种可较好地控制MD,但MDV-1野毒分离株的毒力不断增强,并在免疫鸡群中引发MD,已给世界养禽业造成严重经济损失。作为典型的致瘤性病毒,MDV-1的感染也为研究疱疹病毒引起肿瘤的生物学、遗传学及免疫学提供了良好的动物模型。microRNA(miRNA)是一类新的基因表达调控子,在多数生物学过程中发挥重要的基因转录后调控作用。已有研究发现,在MDV-1的基因组中,14个miRNA前体基因,可加工成26个miRNA,并且集中分布于3个基因簇:Meq基因簇,Mid基因簇和LAT基因簇。目前,已有部分MDV-1 miRNA如miR-M4-5p、miR-M3-5p和miR-M7-5p被证明在MDV复制、潜伏、致病和/或致瘤过程中发挥重要调控作用。但对于其它大部分MDV-1 mi RNA,它们在MDV生物学中潜在的调控作用还不清楚。本研究首先系统分析MDV-1 miRNA在病毒感染宿主及MD淋巴瘤发生过程中的体内动态基因表达谱,并进一步研究MDV-1 miRNA对病毒基因的自我调控作用。本论文的研究内容和结果如下:1首先建立了检测4个MDV蛋白编码基因gB、ICP4、pp38、meq及全部26个病毒miRNA的实时荧光定量RT-PCR(realtime qRT-PCR)的方法,然后对MDV-1超强毒株GX0101感染宿主后3 d、7 d、14 d、21 d、30 d、45 d和60 d的体内动态基因表达谱进行了分析。结果表明,gB、ICP4、pp38、meq基因表达水平的第1个高峰出现在早期溶细胞感染阶段(7 dpi),至潜伏阶段(14 dpi)下降,随后又上升,至晚期溶细胞感染阶段(21 dpi)达到高峰,但在转化与增生阶段(30–60 dpi)gB、ICP4和pp38的表达水平逐渐下降,但meq仍保持较高表达水平,这些结果与“Cornell Model”描述的MD疾病发展过程基本一致,表明GX0101感染宿主的动物实验是成功的。与gB、ICP4、pp38及meq基因的表达模式不同,依据26个MDV-1 miRNA在GX0101感染后的体内动态基因表达谱的差异,可将它们分为3类:第I类包括mi R-M4-5p、miR-M2-5p、miR-M2-3p等12个病毒miRNA,其表达水平自感染后即呈上升趋势,并在14–21 dpi达到第一个高峰,随后到30 dpi有所下降,然后在45–60 dpi又高水平表达,可能与MD致病过程中的潜伏、晚期裂解感染和/或肿瘤增生有关;另外12个miRNA如miR-M4-3p、miR-M7-5p和miR-M11-3p等组成第II类,尽管有些miRNA在45 dpi或60 dpi呈现稍微上升的趋势,但其中大部分miRNA攻毒后的前1-2周以高水平表达,随后以低水平表达,可能与MDV-1生活周期中的早期裂解感染和/或潜伏感染密切相关;第III类包括2个miRNA miR-M5-5p和miR-M5-5p,未表现出一致的表达特征。2利用生物信息学方法对病毒miRNA与MDV病毒基因组进行了预测分析,发现75个病毒蛋白编码基因中存在357个潜在的病毒miRNA结合靶位点。这些候选靶基因的功能涉及基因调节、转化、细胞凋亡、细胞周期控制、免疫调节、病毒复制与传播、蛋白磷酸化、DNA加工和修复等。本研究根据相关病毒基因功能及病毒miRNA的体内动态表达谱,优先选择了与蛋白磷酸化、DNA复制、基因调节和转化相关的候选靶基因10个,成功构建了11个miRNA前体表达载体和26个重组候选靶基因psiCHECKTM-2载体,然后共转染293T细胞,并利用双荧光素酶报告实验对30对候选靶基因3’-UTR靶点/mi RNA组合的相互作用分析,结果显示其中5对3’-UTR靶位点和miRNA组合(MDV025和miR-M4-5p、meq和mi R-M5-3p、meq和miR-M7-5p、meq和miR-M11-5p、meq和miR-M12-5p)中的病毒miRNA能够与对应的3’-UTR靶点相互作用。qRT-PCR进一步分析证实miR-M5-3p、miR-M7-5p、mi R-M11-5p和miR-M12-3p能够共同靶向调控MDV原癌基因meq的表达。综上所述,本研究系统揭示了MDV-1 mi RNA在病毒感染宿主的致病及淋巴瘤发展过程中的动态基因表达谱,为进一步评估和研究MDV-1 miRNA的功能提供了重要的线索。在此基础上,进一步研究证实miR-M5-3p、mi R-M7-5p、miR-M11-5p和miR-M12-3p能够共同靶向调节MDV最重要致瘤基因meq的表达,表明这些病毒miRNA在MEQ促进肿瘤形成的过程中可能发挥重要调节作用,为进一步揭示它们调控MDV感染并致瘤的分子机制奠定了重要基础。