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目的:
本实验在稳定建立大鼠60%减体积肝移植模型基础上,采用高效液相色谱法测定纯度超过98%,剂量为1mg·kg-1·d-1的丹参素,经大鼠腹腔注射,对减体积肝移植后肝脏再生进行干预,以研究丹参素对肝脏再生的影响。
方法:
1.单人直视下大鼠减体积肝移植模型的建立
(1)采用改良的“二袖套法”,单人直视下操作,建立雄性SD大鼠减体积肝移植模型,对预实验阶段和正式实验阶段围手术期时间、手术成功率及术后1周存活率进行比较
(2)分析术后24小时内受体大鼠死亡原因,总结单人直视下大鼠减体积肝移植模型建模技巧。
2.丹参素对大鼠减体积肝移植后肝脏再生的影响
(1)将受体随机分为生理盐水对照组(n=5)和丹参素治疗组(n=5),从减体积肝移植术后3h开始,分别经腹腔注射生理盐水(0.3ml.d1)和用相同体积生理盐水稀释的丹参素(1.0mg·kg-1·d-1),以后每天注射1次相同剂量的生理盐水或丹参素。于术后第1,3,6天每组各处死5只大鼠,取受体肝脏及血标本。
(2)肝再生率称取再生肝湿重,结合术中已经称取的供肝湿重,按照公式:肝再生率=(再生肝湿重-供肝湿重)/供肝湿重×100%,计算肝再生率。
(3)肝功能检测从下腔静脉取血,室温静置20min,1500r离心10min,取血清后送温州医学院第一附属医院检验科检测,采用全自动生化分析仪检测血清ALT、ALB水平。
(4)病理学改变沿纵轴取肝中叶约1.0cm×1.0cm×0.3cm大小组织块,置于4%多聚甲醛中固定24h后包埋切片,HE染色后光镜下观察肝组织损伤、单核细胞浸润及肝有丝分裂细胞。
(5)肝组织PCNA标记指数采用免疫组化SP法检测,细胞核呈棕黄色者为PCNA阳性细胞,每张切片随机观察5个视野(200×),按照阳性细胞数/有核细胞数×100%,计算阳性细胞百分数,取其均值,即PCNA标记指数。
(6)肝组织TNF-α、IL-6取0.2克肝组织,加入冰生理盐水使得终体积为2ml。采用电动匀浆器,转速7000r/min,匀浆5min,再3500r离心15min,取上清,用ELISA法检测肝组织TNF-α、IL-6的表达。
结果:
1.成功建立大鼠减体积肝移植模型。供肝湿重占修剪前全肝湿重的(59±2)%。预实验62次,无肝期(27.67±4.62)min,手术成功率32.3%,1周存活率8.1%,改进操作技巧后正式实验45次,无肝期缩短至(16.27±0.88)min,手术成功率及1周存活率分别为93.3%、66.7%。
2.肝再生率两组肝再生率均呈现逐渐上升的趋势。术后第1、3天,两组肝再生率差异无统计学意义(P>0.05),术后第6天,丹参素治疗组再生率较生理盐水对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。
3.血清AL、ALB水平两组大鼠血清ALT随着术后各时间点推移逐渐降低,血清ALB随着术后各时间点推移逐渐上升。与生理盐水对照组比较,丹参素治疗组术后第3、6天血清ALT均明显降低,血清ALB均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。
4.病理学改变两组大鼠术后第1、3天肝脏汇管区均可见少量单核细胞浸润,肝窦轻度扩张,未见单核细胞浸润,可见肝细胞水肿变性,术后第6天,生理盐水对照组汇管区单核细胞浸润加重,并可见肝窦明显扩张,窦内单核细胞浸润,但肝脏结构基本正常,未见坏死肝细胞,丹参素治疗组与之相比,汇管区单核细胞浸润较少,肝细胞水肿程度轻。两组术后第1天,未见肝有丝分裂细胞,术后第3天均出现较多的肝有丝分裂细胞,但两组未见明显区别。术后第6天,丹参素治疗组肝有丝分裂细胞较生理盐水对照组多。
5.肝组织PCNA标记指数两组PCNA标记指数随时间点的推移逐渐上升。术后第1、3天,两组差异无统计学意义(P>0.05)。术后第6天,丹参素治疗组PCNA标记指数明显高于生理盐水对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。
6.肝组织TNF-α、IL-6两组大鼠各时间点肝组织TNF-α、IL-6均逐渐降低。两组大鼠术后1d肝组织TNF-α、IL-6无统计学差异(P>0.05)。丹参素治疗组术后3、6d肝组织TNF-α、IL-6均明显低于生理盐水对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。
结论:
1.改进单人直视操作技巧后建立的大鼠减体积肝移植模型,稳定可靠,适用于减体积肝移植后肝再生机制及其干预手段的研究;
2.丹参素可以促进大鼠减体积肝移植后肝脏再生,并有助于肝功能的早期恢复,其机制可能与下调TNF-a及IL-6的表达相关。;