目的：　　利用临床标本、动物模型以及体外实验探讨内源性和外源性白细胞介素-17A（Interleukin-17A, IL-17A，也称作IL-17）对骨折急性期愈合过程的影响及其相关机制，旨在为治疗骨折、缩短骨折愈合时间、探索治疗骨不连疾病提供实验依据和新思路。　　方法：　　1.采集单纯长骨骨干骨折患者受伤后不同时间点外周血，以及健康人群志愿者外周血。　　2.采用流式细胞术对骨折患者不同时间点及健康人外周血单核细胞中辅助T细胞-17（T-help-17, Th17）的比例进行分析，并应用ELISA方法检测受试者血清中IL-17A水平。　　3.对临床纳入实验的常见的单纯长骨干骨折患者行骨折切开复位内固定手术，术中提取骨折周围部分软组织标本，免疫组化检测骨折周围部分软组织标本IL-17A的表达水平。　　4.利用C57 BL/6遗传背景的IL-17A-/-小鼠（Knock Out, KO）和野生型（Wild Type, WT）为研究对象，建立野生型和IL-17A-/-小鼠股骨干骨折动物模型。应用X-ray和Micro-CT技术于模型建立后的第3,7,14,21,28天五个时间点，检测实验对象骨折愈合程度。　　5.采用免疫组化技术检测小鼠股骨干骨折动物模型骨折断端周围组织中IL-17A的表达情况；分别应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应技术（qRT-PCR）和免疫蛋白印迹技术(Western blot, WB)检测骨折断端周围组织中成骨相关基因Runx2、Col1、Col2、SOX9、Osterix的mRNA表达以及β-catenin、SOX9、Col2、Osterix的蛋白表达水平。　　6.分别从C57 BL/6WT和IL-17AKO新生小鼠的颅骨制备原代成骨细胞，分别应用qRT-PCR和WB技术检测上述细胞成骨相关基因β-catenin、SOX9、Col1、Col2和Runx2的mRNA及其蛋白水平；分别以rhIL-17A、rhIL-17A+DKK1（β-catenin抑制剂）、rhIL-17A+DAPT（Notch抑制剂）处理上述细胞，培养3、7天，以qRT-PCR和WB技术检测成骨相关基因β-catenin、SOX9、Col1、Col2和Runx2的mRNA及其蛋白表达水平。　　结果：　　1.本研究共纳入诊断为单纯长骨干骨折患者22例，经筛选配对，共入选志愿者22例。患者组与健康对照组之间年龄、性别等一般资料均未见统计学差异。　　2.被纳入的单纯长骨干骨折患者在受伤后第1天，和对照组相比，外周血中Th17细胞比例稍高（P＜0.05）；在观察点内固定手术后第3天，和对照组相比外周血中Th17细胞比例明显升高（P＜0.01），与受伤后第1天相比也明显升高（P＜0.01）；在术后第7天与术后第1天相比，Th17细胞比例降低（P＜0.05），与对照组相比，Th17细胞比例仍然稍高，但不存在统计学意义（P＞0.05）。　　3.血清IL-17A含量使用 ELISA检测法结果显示，受伤后第1天，血清 IL-17A含量较对照组基线开始升高，在术后第3天明显升高，与骨折后第1天对比存在统计学意义（P＜0.01），术后第7天较骨折后第1天也有所升高，但不存在统计学意义。　　4.X-ray结果显示：骨折模型建模后第3天，KO及WT实验模型小鼠的骨折断端对位对线均较好，骨折断端两侧无明显扭转、位移，错位程度在正常范围；骨折线都较为清晰，骨折断端周围尚无新生骨痂形成；这两种实验模型小鼠皆处于血肿机化期。骨折模型建模后第7天，KO及WT实验模型小鼠的模型骨折断端对位对线较好，骨折断端两侧无明显扭转、位移；两种实验模型小鼠骨折断端都较3天更为清晰，骨折断端周围尚无新生骨痂形成。骨折模型建模后第14天，KO及WT实验模型小鼠骨折断端周围出现骨痂影，骨折线开始模糊。骨折模型建模后第21天，KO及WT实验模型小鼠骨折断端周围出现大量骨痂影，成纺锤型影像影，WT实验小鼠骨折线已经消失。骨折模型建模后第28天， KO及WT实验模型小鼠股骨折断端处骨痂较前时相缩小，WT实验组小鼠骨折断端处改建已经基本完成。　　5. Micro-CT发现在建模3天后骨折断端可见骨折断端对合良好，KO及WT实验模型小鼠股骨标本设定兴趣区BV/TV值无显著差异；而在建模后7、14、21天发现WT模型组较KO模型组骨折断端周围较早出现新生骨痂，形态呈坡形隆起，骨痂内有新生骨组织，KO及WT两组实验模型小鼠的股骨标本设定兴趣区BV/TV值存在明确显著性差异（P<0.05），KO模型组骨折断端骨量较WT模型组减低。建模后28天，KO及WT实验模型小鼠股骨骨折断端均已愈合完成改建，KO及WT实验模型小鼠股骨标本设定兴趣区BV/TV值无显著差异（P>0.05）。　　6.采用免疫组织化学技术分析小鼠骨折模型股骨组织标本中IL-17A的表达：WT模型组小鼠股骨组织标本在建模后3、7、14天骨折断端周围软组织及骨痂中均有IL-17A的表达，建模后3、7天表达强度较高； KO模型组小鼠股骨组织标本在建模后3、7、14天骨折断端周围软组织及骨痂中均无IL-17A的表达。在模型建立后21、28天，KO及WT实验模型小鼠股骨组织标本骨折断端周围软组织及骨痂中均未探测到IL-17A的表达。　　7.实时荧光定量RT-PCR分析结果：在建模后第3、7、14天，WT模型组小鼠股骨骨折断端处周围软组织及骨痂组织标本中β-catenin、SOX9、Col1、Col2、Osterix和Runx2的mRNA的转录水平均显著高于KO模型组组织标本（P<0.05）。在建模后第21天，WT模型组小鼠股骨骨折断端处周围软组织及骨痂组织标本中Col1、Col2及β-catenin的mRNA的转录水平依然显著高于KO模型组组织标本（P<0.05），然而SOX9、Osterix和Runx2的mRNA的转录水平在两组之间已无显著性差异（P>0.05）。在建模后第28天，WT模型组小鼠股骨骨折断端处周围软组织及骨痂组织标本中Col2与β-catenin的mRNA的转录水平持续显著高于KO模型组组织标本，两组间扔存在显著性差异（P<0.05），Col1、SOX9、Osterix和Runx2的mRNA的转录水平在两组之间已无显著性差异（P>0.05）。　　8.两组骨折模型造模后第0天，目标蛋白β-catenin、SOX9、Col1、Col2、Osterix在两组骨折断端处周围软组织标本中表达并未见显著性差异（P>0.05）；骨折模型造模后第3、7、14、21天，β-catenin、SOX9、Col1、Col2、Osterix表达均有显著差异（P<0.05），KO组小鼠骨折断端处周围软组织标本表达量明显低于WT组；但是于骨折模型造模后第14天，SOX9蛋白表达未见明显差异，骨折模型造模后第21天，Col2蛋白表达水平未见显著性差异；骨折模型造模后第28天，Col2、SOX9蛋白表达水平仍有显著性差异，β-catenin、Osterix蛋白表达水平未见显著性差异（P>0.05）。　　9. WT小鼠原代成骨细胞中β-catenin、SOX9、Col1、Col2、BMP2、Runx2的转录水平均高于KO小鼠原代成骨细胞；靶分子β-catenin在外源性的IL-17A存在的情况下mRNA的转录水平显著高于KO组的转录水平，β-catenin抑制剂DKK1可以明显抑制各组中β-catenin的转录表达水平，同时降低了成骨相关 SOX9、Col1、Col2、BMP2、Runx2的转录水平；在连续培养3-7天，我们发现DKK1可以明显抑制各组中β-catenin的转录表达水平，并且使成骨细胞各成骨相关基因转录水平峰值后移；IL-17A对成骨细胞的调节作用的机制可能依赖Wnt信号通路。并且，在对外源性IL-17A刺激的响应上，IL-17A-/-基因敲除小鼠的成骨细胞成骨相关基因的表达，与WT小鼠相比更加后滞，这说明IL-17A-/-基因敲除小鼠对外源性IL-17A的刺激响应不敏感。　　10. WT小鼠原代成骨细胞中Notch、Hes1、Rjbpκ的转录水平均低于KO小鼠原代成骨细胞，但Col2、Osterix的转录水平均高于KO小鼠原代成骨细胞；在外源性的IL-17A存在的情况下，WT组靶分子Notch、Rjbpκ的mRNA转录水平显著低于KO组；Notch抑制剂DAPT明显下调了各组中Notch、Rjbpκ的转录表达水平，同时上调了成骨相关Col2、Osterix的转录水平；IL-17A对Notch信号转导通路也存在调控作用；IL-17A对KO及WT小鼠原代成骨细胞中Notch、Rjbpκ蛋白水平的表达有抑制作用，在加入DAPT后，Notch、Rjbpκ蛋白水平的表达受抑制，成骨蛋白Col2、Osterix的表达增强，这种较强的作用持续到连续培养的第5天，而后呈现下降的趋势，这种作用于7天后趋于平稳；并且，与WT小鼠成骨细胞相比，IL-17A-/-基因敲除小鼠的成骨细胞对于外源性IL-17A的刺激的信号调控存在显著性差异；WT小鼠成骨细胞对外源性IL-17A的刺激更加敏感。　　结论：　　通过体外实验、动物实验和临床标本分析，本研究结果提示：IL-17A可参与骨折愈合的整个过程，促进骨折断端周围组织中β-catenin、SOX9、Col1、Col2、Osterix等重要的成骨相关分子的表达；IL-17A不仅可以加速创伤后炎性反应过程，并且进一步促进骨折愈合过程，其通过分别调控Wnt及Notch信号通路而对成骨细胞的发育以及骨折的愈合起到调节作用。因此，IL-17A可能是骨折后炎性反应的一个重要因子，其对骨折愈合进程的调节很可能成为治疗骨缺损和骨不连的一个重要研究方向。