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鼠伤寒沙门菌SseK3蛋白是新发现的一种沙门菌三型分泌系统T3SS分泌的效应蛋白，T3SS分泌的多种效应蛋白在沙门菌侵袭宿主细胞、炎症发生及沙门菌囊泡成熟等方面均发挥着重要作用，但目前国内外关于sseK3基因的研究甚少，对sseK3基因的功能及其作用机制尚不清楚。因此，本研究对sseK3基因进行克隆并进行了生物信息学分析，运用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术对鼠伤寒沙门菌sseK3基因进行敲除，构建了鼠伤寒沙门菌sseK3基因缺失菌株及其回复菌株，并对其生物学特性进行了检测，探究sseK3基因对鼠伤寒沙门菌生物学特性的影响。由于细菌分泌蛋白可影响细胞代谢，导致细胞凋亡，且细胞糖酵解与凋亡之间存在联系。因此，为探究sseK3基因敲除对鼠伤寒沙门菌诱导巨噬糖酵解及细胞凋亡的影响，本研究分别将各菌株与巨噬细胞共孵育，检测巨噬细胞糖酵解和凋亡情况。为进一步阐明sseK3基因在鼠伤寒沙门菌中的功能以及明确sseK3在细菌感染过程中确切作用奠定基础。主要研究内容如下：
1.鼠伤寒沙门菌SL1344株sseK3基因的克隆及生物信息学分析
通过PCR扩增获得鼠伤寒沙门菌sseK3基因，利用生物信息学方法进行系统性分析。测序结果显示，sseK3基因大小为1008bp，编码335个氨基酸，蛋白理论分子质量为37.89KD，分子式为C1700H2629N463O497S12，等电点为6.7，属于稳定存在的亲水蛋白质。该蛋白含有5个N-糖基化位点、3个O-糖基化位点、33个磷酸化位点、22个B细胞线性结合位点和11个T细胞结合位点以及21个二硫键位点。二级结构中，α-螺旋（Hh）占34.03%（114个），伸展链（Ee）占21.49%（72个），β-折叠（Tt）占8.96%（30个），无规则卷曲（Cc）占35.52%（119个）。
2.鼠伤寒沙门菌SL1344株sseK3基因缺失菌株的构建
以大肠杆菌x7213（pREΔsseK3）作为供体菌，鼠伤寒沙门菌SL1344为受体菌，通过自杀性质粒介导细菌基因的接合转移方法，两步筛选sseK3基因缺失菌株。PCR鉴定和测序结果显示，成功构建sseK3基因缺失菌株。将PCR扩增sseK3基因连接至pMD18-T构建重组质粒pMD18-T-sseK3，测序正确的重组质粒经HindⅢ与BamHⅠ酶切后，将目的基因连接至pBR322，得到重组质粒pBR322-sseK3，PCR和酶切鉴定正确后将重组质粒电转化至sseK3基因缺失菌株构建回复菌株，用于后续探究sseK3基因在鼠伤寒沙门菌感染过程中的作用及其机制。
3.sseK3基因缺失对鼠伤寒沙门菌SL1344生物学特性的影响
为探究sseK3基因缺失对鼠伤寒沙门菌的影响，比较分析鼠伤寒沙门菌株SL1344亲本菌株、sseK3缺失菌株及sseK3回复菌株的生物学特性。结果显示，sseK3缺失菌株、sseK3回复菌株和亲本菌株的血清型均为1,4,[5],12:i:1,2，生化特性和生长速度无明显差异，且sseK3缺失菌株能够稳定遗传。sseK3缺失菌株的生物被膜形成比亲本菌株明显减少，同时，sseK3回复菌株的生物被膜恢复至亲本菌株的水平，这表明sseK3基因对于鼠伤寒沙门菌生物被膜的形成是必需的。粘附力和侵袭力检测结果显示，sseK3缺失菌株对HeLa细胞的粘附和侵袭与亲本菌株相比无显著差异（P＞0.05）。sseK3缺失菌株在巨噬细胞内的增殖显著低于亲本菌株（P＜0.05）。此外，sseK3缺失菌株口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为2.96×108CFU，较亲本菌株降低约1035倍。免疫保护效力检测显示，sseK3缺失菌株免疫小鼠后第17天保护率为66.7%。第14天血清IgG达到最高水平。表明sseK3基因的缺失能够降低鼠伤寒沙门菌的毒力，并且sseK3缺失菌株具有一定的免疫原性。
4.sseK3基因缺失对鼠伤寒沙门菌诱导巨噬细胞糖酵解及凋亡的影响
以鼠伤寒沙门菌SL1344亲本菌株、sseK3缺失菌株及sseK3回复菌株分别感染巨噬细胞RAW264.7，建立细胞感染模型，利用糖酵解相关检测试剂盒、流式细胞术、Caspases活性检测试剂盒等分别检测细胞糖酵解与凋亡情况，探究sseK3在鼠伤寒沙门菌感染巨噬细胞过程中对巨噬细胞糖酵解和凋亡的影响。结果显示，sseK3缺失菌株与亲本菌株对巨噬细胞的粘附和侵袭差异不显著（P＞0.05）。sseK3缺失菌株感染组、亲本菌株感染组和sseK3回复菌株感染组之间的丙酮酸激酶活性与丙酮酸含量均无显著性差异（P＞0.05）。然而，sseK3缺失菌株感染组中的乳酸含量低于亲本菌株感染组和sseK3回复菌株感染组，其差异显著（P＜0.01）。但sseK3缺失菌株感染组中的ATP含量显著高于亲本菌株感染组和sseK3回复菌株感染组（P＜0.01）。流式细胞术分析发现sseK3缺失菌株感染组的巨噬细胞凋亡率低于亲本菌株感染组和sseK3回复菌株感染组。sseK3缺失菌株感染组的Caspase-1、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9酶活性与亲本菌株感染组和sseK3回复菌株感染组相比明显降低，其差异显著（P＜0.01），这表明sseK3能够提高Caspase-1、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9酶的活性。表明sseK3基因增强鼠伤寒沙门菌感染巨噬细胞的糖酵解水平和促进鼠伤寒沙门菌感染巨噬细胞的凋亡。
1.鼠伤寒沙门菌SL1344株sseK3基因的克隆及生物信息学分析
通过PCR扩增获得鼠伤寒沙门菌sseK3基因，利用生物信息学方法进行系统性分析。测序结果显示，sseK3基因大小为1008bp，编码335个氨基酸，蛋白理论分子质量为37.89KD，分子式为C1700H2629N463O497S12，等电点为6.7，属于稳定存在的亲水蛋白质。该蛋白含有5个N-糖基化位点、3个O-糖基化位点、33个磷酸化位点、22个B细胞线性结合位点和11个T细胞结合位点以及21个二硫键位点。二级结构中，α-螺旋（Hh）占34.03%（114个），伸展链（Ee）占21.49%（72个），β-折叠（Tt）占8.96%（30个），无规则卷曲（Cc）占35.52%（119个）。
2.鼠伤寒沙门菌SL1344株sseK3基因缺失菌株的构建
以大肠杆菌x7213（pREΔsseK3）作为供体菌，鼠伤寒沙门菌SL1344为受体菌，通过自杀性质粒介导细菌基因的接合转移方法，两步筛选sseK3基因缺失菌株。PCR鉴定和测序结果显示，成功构建sseK3基因缺失菌株。将PCR扩增sseK3基因连接至pMD18-T构建重组质粒pMD18-T-sseK3，测序正确的重组质粒经HindⅢ与BamHⅠ酶切后，将目的基因连接至pBR322，得到重组质粒pBR322-sseK3，PCR和酶切鉴定正确后将重组质粒电转化至sseK3基因缺失菌株构建回复菌株，用于后续探究sseK3基因在鼠伤寒沙门菌感染过程中的作用及其机制。
3.sseK3基因缺失对鼠伤寒沙门菌SL1344生物学特性的影响
为探究sseK3基因缺失对鼠伤寒沙门菌的影响，比较分析鼠伤寒沙门菌株SL1344亲本菌株、sseK3缺失菌株及sseK3回复菌株的生物学特性。结果显示，sseK3缺失菌株、sseK3回复菌株和亲本菌株的血清型均为1,4,[5],12:i:1,2，生化特性和生长速度无明显差异，且sseK3缺失菌株能够稳定遗传。sseK3缺失菌株的生物被膜形成比亲本菌株明显减少，同时，sseK3回复菌株的生物被膜恢复至亲本菌株的水平，这表明sseK3基因对于鼠伤寒沙门菌生物被膜的形成是必需的。粘附力和侵袭力检测结果显示，sseK3缺失菌株对HeLa细胞的粘附和侵袭与亲本菌株相比无显著差异（P＞0.05）。sseK3缺失菌株在巨噬细胞内的增殖显著低于亲本菌株（P＜0.05）。此外，sseK3缺失菌株口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为2.96×108CFU，较亲本菌株降低约1035倍。免疫保护效力检测显示，sseK3缺失菌株免疫小鼠后第17天保护率为66.7%。第14天血清IgG达到最高水平。表明sseK3基因的缺失能够降低鼠伤寒沙门菌的毒力，并且sseK3缺失菌株具有一定的免疫原性。
4.sseK3基因缺失对鼠伤寒沙门菌诱导巨噬细胞糖酵解及凋亡的影响
以鼠伤寒沙门菌SL1344亲本菌株、sseK3缺失菌株及sseK3回复菌株分别感染巨噬细胞RAW264.7，建立细胞感染模型，利用糖酵解相关检测试剂盒、流式细胞术、Caspases活性检测试剂盒等分别检测细胞糖酵解与凋亡情况，探究sseK3在鼠伤寒沙门菌感染巨噬细胞过程中对巨噬细胞糖酵解和凋亡的影响。结果显示，sseK3缺失菌株与亲本菌株对巨噬细胞的粘附和侵袭差异不显著（P＞0.05）。sseK3缺失菌株感染组、亲本菌株感染组和sseK3回复菌株感染组之间的丙酮酸激酶活性与丙酮酸含量均无显著性差异（P＞0.05）。然而，sseK3缺失菌株感染组中的乳酸含量低于亲本菌株感染组和sseK3回复菌株感染组，其差异显著（P＜0.01）。但sseK3缺失菌株感染组中的ATP含量显著高于亲本菌株感染组和sseK3回复菌株感染组（P＜0.01）。流式细胞术分析发现sseK3缺失菌株感染组的巨噬细胞凋亡率低于亲本菌株感染组和sseK3回复菌株感染组。sseK3缺失菌株感染组的Caspase-1、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9酶活性与亲本菌株感染组和sseK3回复菌株感染组相比明显降低，其差异显著（P＜0.01），这表明sseK3能够提高Caspase-1、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9酶的活性。表明sseK3基因增强鼠伤寒沙门菌感染巨噬细胞的糖酵解水平和促进鼠伤寒沙门菌感染巨噬细胞的凋亡。