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丝状真菌退化是一种普遍的现象,形态上表现为菌落气生菌丝徒长、菌落角变、产孢能力下降或丧失、毒力和次级代谢产物合成能力下降等问题。这严重影响了许多丝状真菌的经济性状,给大规模生产及菌种保藏工作带来损失。目前人们对于丝状真菌退化机理还知之甚少。 通过比较转录组学研究,我们实验室在早期的研究中发现绿僵菌中一些参与胁迫响应和衰老相关的基因在退化菌株中发生上调,推测退化菌株表现为衰老现象。在本论文研究中,我们发现活性氧积累引起的线粒体损伤是导致菌株退化的机制之一。在金龟子绿僵菌退化菌株中,我们检测到菌丝细胞中大量活性氧的积累,而向野生菌株加入外源的过氧化氢能够明显增加其退化的频率。相对于较易退化的金龟子绿僵菌菌株V275,不易退化的蝗绿僵菌菌株ARSEF324具有更强的清除活性氧的能力。这些结果表明真菌细胞中活性氧的积累与退化相关。线粒体是细胞内产生活性氧的主要场所,也是活性氧损伤的直接靶点。我们发现退化菌株的线粒体受到了损伤,表现为线粒体DNA脱氧鸟嘌呤发生了非酶促糖基化以及线粒体膜电位下降。间接实验证明DNA糖基化影响了DNA的结构和功能。 我们进一步以模式真菌构巢曲霉为研究对象,对正常菌株及菌落角变产生的退化菌株的线粒体蛋白进行比较蛋白组学分析。通过非标记蛋白定量技术及Griffin算法,与野生型菌株相比,我们在退化菌株中得到92个表达水平发生显著变化的线粒体蛋白,并用生化及细胞学实验对部分蛋白参与的生物学过程进行了验证。实验数据表明退化菌株细胞代谢能力增强,线粒体内的钙离子、铁离子等浓度升高、谷氨酸合成增强,这些都是活性氧产生的主要原因。抗氧化相关蛋白的下调使得更多的活性氧积累于退化菌株的细胞中,从而使细胞受到氧化胁迫并进一步导致线粒体结构及功能损伤。负责修复线粒体蛋白及清除损伤线粒体蛋白酶类的下调,使细胞积累了大量损伤的线粒体,这些因素都加速了细胞衰老。此外,退化菌株也表现出褐脂及细胞壁黑色素的积累等衰老特征。退化菌丝中大量积累的活性氧及其造成的线粒体损伤暗示活性氧可能是引起菌丝退化及丧失产孢能力的主要原因。通过在培养基中加入活性氧抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸能够使退化菌株部分恢复产孢能力。 总之,通过本论文的实验研究,我们证明了丝状真菌菌株退化与活性氧积累的关联性;退化菌株中的线粒体蛋白表达特征发生明显变化,与线粒体代谢、物质转运及胁迫响应等相关蛋白表达水平显著上调;退化菌株细胞的代谢能力增强,加速了活性氧等废物积累。我们的研究结果很好地支持了生物衰老的线粒体及活性氧理论,为预防丝状真菌菌种退化提供了很好的理论及技术支撑。