蝙蝠是巨大的病毒库,有关蝙蝠携带“新”病毒的研究逐年增加,正不断地补充其病毒库的构成。消化道,作为开放性的腔道,沟通蝙蝠与外界环境,为疾病的传播提供可能。目前,关于蝙蝠携带腺病毒、疱疹病毒、轮状病毒、乳头状瘤病毒及杯状病毒已见文献报导,但多见于其他地区,中国境内少见报导或缺乏流行病学资料,各个研究中收集的蝙蝠种属比较单一。定期对各个地区,不同蝙蝠种属进行病毒检测,有助于了解蝙蝠-病毒间的宿主-病毒关系及其病毒的进化情况。本研究拟对来自广东广州、惠州、云浮以及海南海口四地的520份蝙蝠粪便及直肠标本携带的腺病毒、疱疹病毒、轮状病毒、乳头状瘤病毒、杯状病毒及细小核糖核酸病毒进行流行病学调查及进化溯源分析。已有研究表明蝙蝠的脑、肠道、肺脏、肾脏、肝脏及血液中携带各种各样的病毒。但以往的研究对特定病毒的检测多采用特定的、传统的研究方法,包括培养分离、电镜观察、血清学方法诊断、PCR、杂交等。这些方法都存在一定的局限性,尤其是当检测病毒或其核酸信息未知时,不利于新型病毒的发现。全面掌握蝙蝠携带病毒的本底资料,了解各种病毒的丰度信息,及时发现新发传染原,对于病毒在疾病传播过程中的作用和防治具有重要意义。作为一种有利于未知病毒发现的高效工具,病毒宏基因组学已广泛用于对各种环境介质中的病毒组学研究。蝙蝠病毒宏基因组学研究也在开展和深入进行中,目前,已有7个关于蝙蝠病毒宏基因组学的研究,一定程度上反映了蝙蝠携带病毒的多样性,提供了有价值的数据。4个来自中国境内,采用宏基因组测序探究蝙蝠体内携带病毒的研究,大部分采用各种组织的混合样品,形成预混池,提取核酸,文库构建,进行测序。一定程度上,降低了某些病毒检出阳性率,忽略了病毒存在的源组织,然而,病毒所富集的组织将进一步指导该病毒可能的传播途径。另外,逐个病毒检测工作量巨大,也受到常规检测方法敏感性的影响,且不能发现未知的病毒。本研究拟建立基于Solexa高通量测序的方法,重点关注蝙蝠肠道及粪便携带的病毒,为研究粤、琼两地蝙蝠携带病毒的提供自然本底,以进一步指导未来的蝙蝠相关病毒的分子流行病学调查和预防实践。1研究方法1.1蝙蝠标本的采集2011年7月至2014年8月,于海南海口、广东惠州、云浮及广州四个地方的蝙蝠监测点中,选取9个蝙蝠自然栖息地(居民区,城市公园,废弃的住宅和岩洞),现场捕捉蝙蝠,对捕捉蝙蝠进行编号。采集每只捕获蝙蝠的粪便,肛拭子以及剪取直肠组织标本。利用细胞色素b基因,辅之以蝙蝠研究专家进行形态学鉴定,最终确定捕捉蝙蝠种属。1.2六种常见病毒的调查研究提取520份蝙蝠粪便及直肠标本病毒RNA或DNA。对病毒RNA进行逆转录成cDNA,利用巢式PCR或普通PCR检测其携带轮状病毒、杯状病毒及细小核糖核酸病毒病毒的情况;对病毒DNA进行巢式PCR或普通PCR,检测蝙蝠标本中携带疱疹病毒,腺病毒和乳头状瘤病毒的情况。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,亮带直接送测序,如果条带较弱则进行切胶、纯化和回收,然后送样至公司测序。利用生物信息学的方法,进行同源性分析,多序列比对,构建系统进化树,计算各序列间的距离矩阵。1.3病毒宏基因组学研究按照地理位置和蝙蝠种类分为6组:GZ.CS(广州犬蝠组)、HN.MS(海南长翼蝠组)、HN.RL(海南棕果蝠组)、HZ.HL(惠州中蹄蝠组)、YF.RB(云浮小菊头蝠组)、YF.SK(云浮小黄蝠组)。每组选取10-15只蝙蝠进行去背景核酸处理,RNA/DNA病毒核酸提取,逆转录和单链cDNA补平形成双链dc-DNA。应用随机引物对dc-DNA进行随机扩增,对扩增产物进行检测鉴定,建库测序。对每组标本进行病毒注释和丰度分析。基于宏病毒组学高通量测序结果,对满足要求的逆转录病毒、腺病毒进行进行同源性分析,多序列比对,构建系统进化树,计算各序列间的距离矩阵。2结果2.1六种常见病毒的检测结果520份标本中,疱疹病毒、腺病毒、乳头状瘤病毒、轮状病毒检测的阳性率分别是:73%、6.9%、2.1%及0.76%。未检出细小核糖核酸病毒和杯状病毒。本研究蝙蝠疱疹病毒(HVs)分属于两种型别:β疱疹病毒属(4株)和γ疱疹病毒属(69株)。尚未在蝙蝠中发现α疱疹病毒属。以HVsDPOL基因及gB基因构建的进化树研究结果提示,本研究不同地域,不同蝙蝠种属HVs DPOL基因及gB基因具有多样性,蝙蝠HVs与其宿主具有协同进化的关系。36株蝙蝠AdVs均属于哺乳动物腺病毒属,但与其他动物(包括人)的AdVs距离较远,氨基酸相似性较低。11株蝙蝠乳头状瘤(PVs)的氨基酸相似性高,相似度为94.5%-100%,而与现有发现的其他动物及蝙蝠PVs相比,相似度较低,仅有34.5-58.9%。与其他动物相比,4株小黄蝠A组轮状病毒(RVA)与一株猴子RVA和狗RVA相似度最高,为80.2%,可初步判断为G3型别。2.2六组蝙蝠病毒宏基因组测序结果6组标本经宏病毒组测序,一共得到数据量为108,443,256个读长(reads),其中,病毒reads为18,261,633条,真核生物,古生菌细菌和其他未能识别的reads为90,181,623条。病毒reads经过拼接得到13,466,976个重叠序列(contigs),平均长度为182bp,大于500bp的contigs有5496个,平均长度为776bp。蝙蝠各组的数据大小介于8,191,142到35,722,372条reads之间,最少的为YF.RB,而最多的为HN.RL。此次研究组装的病毒相关的contigs中,Deltaretrovirus相关的contigs最多,达到了 1424条,在HN.RL组中分布最多,注释信息显示与Pteropus vampyrus endogenous retrovirus group K的pol基因的同源性最为相似,为90%。从注释到的信息来看,Phlebovirus-、Tospovirus-、RotavirusA-、Mastarenavirus、Picobirnavirus-、Simplexvirus-、Varicellovirus-、Mastadenovirus-、Circovirus-、Mamastrovirus-、Coronavirus-、Orthohepadnavirus-、Reoviridae、Iflavirus-、Bracovirus-、Bracovirus-、Orthopoxvirus、Orthopoxvirus、Vesiculovirus-、Chrsovirus-以及所有的Phage-like contigs与现有数据库中的序列的同源性基本上都在 80%以上;而余下的序列,如Alphapapillomavirus-Deltaretrovirus-、Gammaretrovirus-、Alpharetrovirus-、Lymphovirus-、Cytomegalovirus-、Ictalurivirus-、Chlorovirus-、Cucumovirus-contigs,与现有的序列的同源性均低于70%。通过比较发现,不同病毒存在一定的地域特点。2.3反转录病毒(ReVs)和腺病毒(AdVs)基因序列的初步分析来源于HN.RL蝙蝠ReVs序列主要为蛋白酶/聚合酶(Pol)以及包膜蛋白(Env)两个基因,分别与马来狐蝠ReVs的相似度最高,达78-90%。Env基因在BLASTx数据库中经翻译比对后,均在序列中间发现终止密码子。对Pol基因构建进化树发现 HN.RL 的 ReV 与马来狐蝠的 ReVs(Pteropus vampyrus endogenous retroviruses)聚在同一支上,相似度为85.7%。对腺病毒E4orfl基因构建系统进化树,发现来源于GZ.CS和HN.MS组的contigs与人腺病毒C型(human AdV-C)聚在同一支,相似度为94.1-100%。利用IVa2基因构建进化树得知,本研究HN.MS的AdV contig与human AdV-C聚在同一支,相似度为100%。3结论3.1首次在小黄蝠、中蹄蝠、翘尾蝠及犬蝠体内发现疱疹病毒,扩大了蝙蝠携带HVs的种属认知。蝙蝠体内高HVs的携带率,低致病性以及蝙蝠HVs的多样性,提示了蝙蝠与HVs之间可能存在共进化的关系。本研究3株蝙蝠HVs(SK/11HZ85,CS/13HN70 and RB/13YF87)与 Macavirus 病毒属的牛疱疹病毒 6型(BOHV6)聚在同一支,DPOL和gB基因氨基酸相似度高,提示了跨种属的可能。3.2本研究发现蝙蝠间腺病毒具有多样性,首次在犬蝠体内检测出腺病毒。基于本研究及目前文献报道结果,蝙蝠AdVs与人AdVs具有种属特异性。尚无证据证明蝙蝠与人之间的AdVs能进行跨种属传播。仍需进一步详细的蝙蝠、人AdVs基因组学信息和流行病学调查资料研究证明两者间关系。3.3首次在小黄蝠和小菊头蝠中发现乳头状瘤病毒,为新的PV型别,但不能确定其病毒分属情况。本研究2株小黄蝠PVs和9株小菊头蝠PVs聚在同一支上,相似度高,未显示PVs具有严格的种属特异性及与宿主共进化关系。3.4根据RCWG的标准,可将本研究发现的四株小黄蝠RVAs初定为G3型别。3.5未从520份蝙蝠粪便、直肠及肛拭子标本中检测出杯状病毒和细小核糖核酸病毒。考虑可能是蝙蝠本身CV/PiV携带率低,病毒载量不足以及检测方法不够灵敏等原因造成。3.6建立了基于高通量测序的蝙蝠粪便/直肠的病毒宏基因学方法,重点关注蝙蝠肠道及粪便携带的病毒,检测到大量脊椎动物、昆虫、植物、古生菌、细菌、真菌和藻类病毒的核酸序列。发现了多个潜在的新型病毒,如:甲型乳头状瘤病毒、丙型逆转录病毒,乙型逆转录病毒,巨细胞疱疹病毒、淋巴滤泡疱疹病毒。不同病毒呈现一定地域特点。3.7初步分析了蝙蝠反转录病毒pol基因的生物信息学信息,提示棕果蝠及马来狐蝠之间的ReVs存在跨种属传播的可能,而ReV在不同蝙蝠种属体内携带的多样性,提示蝙蝠可作为该病毒传播的合适媒介。