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我们前期研究证明,咪唑类物质KK-42处理凡纳滨对虾(Penaeus schmitti)幼虾,能显著促进动物生长,但作用机理并不清楚。凡纳滨对虾等甲壳动物的生长发育是通过周期性蜕皮来实现,其过程由甲基法呢酯(MF)和蜕皮激素(MH)协同分级调控。物质积累是动物生长的前提和基础,为蜕皮提供物质和能量。本论文以凡纳滨对虾为材料,研究了KK-42对动物生长发育相关基因时空表达的影响,结合测定血淋巴MF和MH滴度,旨在从分子水平探讨KK-42促生长的机制。采用浸润法,用1.95×10-4mol/L的KK-42对凡纳滨对虾幼虾(体长3.5-5.0 cm)进行处理,浸润时间为1 min,然后按正常方法饲养。实验过程中定期采样,解剖取其不同组织,在不同时间抽取血淋巴。采用荧光实时定量PCR技术检测相关基因的转录水平；采用正相、反相高效液相色谱分别检测血淋巴中MF和MH的滴度。结果如下：KK-42处理之后,肝胰腺胰蛋白酶mRNA水平在前6天升高>42.6%(P<0.05),之后恢复到对照组水平;从第1-7天,血蓝蛋白mRNA水平增加>54.6%(P<0.05)；实验期间,组蛋白酶L mRNA含量>、51.9%(P<0.05),几丁质酶mRNA水平升高56.1%；N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶mRNA量前6天升高>135.5%(P<0.01),之后回到对照水平。KK-42可显著下调α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的表达,与对照组相比,mRNA水平分别减少51.9%和57.2%以上。首次从凡纳滨对虾肝胰腺分离出HSP90全基因序列,该基因cDNA 2543 bp,开放阅读框2160 bp,编码720个氨基酸。氨基酸残基中含有HSP90保守结构域,与已知的节肢动物HSP90基因结构一致。与其它物种HSP90蛋白进行同源性比对,与甲壳动物虾类同源关系最近,其次是昆虫,而和脊椎动物HSP90同源关系较远。研究发现,hsp90和hsp 70在凡纳滨对虾不同组织都有表达,其中肝胰腺中表达水平较高。实验期间,肝胰腺中两种HSP mRNA水平虽有一定波动,但含量相对较低；KK-42处理可显著诱导HSP70和HSP90的表达,处理后第1-3天,HSP70和HSP90 mRNA含量分别比相应的对照组升高了243.4%、141.3%、410.5%和121.6%、505.5%、481.7%。3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR)、法呢酸-O-甲基转移酶(farnesoic acid O-methyltransferase, FAMeT)和MF酯酶(MF esterase, MFE)在MF合成和降解过程中发挥重要作用,相应的基因表达各有特点。HMGR mRNA水平在大颚器官(MO)最高,其次是眼柄,肌肉和肝胰腺水平最低。KK-42处理可显著抑制眼柄和MO中HMGR表达,但二者下调模式不相同,前者mRNA水平在各时间点之间没有明显差异(P>0.05)；而在MO下调幅度出现明显波动,其中在第1和7天,mRNA含量分别下降了82.5%和90.7%。FAMeT mRNA在眼柄、肌肉组织中的表达模式与MO明显不同：前者组织中mRNA水平相对较低且变化较小,而在MO则出现明显的波动,第2、6、7、8天FAMeT mRNA含量比第0天均增加1倍以上(P<0.01)。KK-42处理后,上述三个组织中FAMeT表达均出现不同程度下调,尤以MO最为显著,其中第6天mRNA水平降低63.4%(P<0.01)。KK-42处理能够明显诱导肝胰腺MFE转录,降低血淋巴MF滴度。首次从肝胰腺克隆出CYP4V18全基因序列,开放阅读框为1545bp,编码515个氨基酸,其中包含CYP 450保守序列。系统进化显示,CYP4V18与岸蟹CYP4C39和沟虾CYP4C15蛋白同源性分别达到71.3%和59.5%。CYP4V18 mRNA水平在肝胰腺最高,分别是脑、Y-器官和肌肉组织的4、26和32倍。KK-42处理可显著抑制CYP4V18表达,第六天抑制率达到187.7%(P<0.01)；血淋巴20E滴度逐渐升高。结论：在转录水平上,KK-42能诱导凡纳滨对虾肝胰腺胰蛋白酶、血蓝蛋白、组蛋白酶L、几丁质酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的表达,对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶具有抑制作用,上调肝胰腺HSP90和HSP70基因的表达。这可能增强了动物对蛋白质的利用,提高了动物的耐受性,有利于动物的快速生长。再有,KK-42能分别降低和升高血淋巴MF、MH滴度,这是加快动物异速生长的原因之一,其分子机制可能与HMGR、FAMeT、CYP4V18表达的抑制和MFE转录水平的提高有关。