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骨髓间充质干细胞（BMSCs）是从骨髓分离得到的多能性成体干细胞，在临床再生医学和细胞移植治疗等方面具有很大的应用潜能，在体外分离培养绵羊BMSCs 的过程中，其增殖能力和多向分化潜能的保持遭遇到困难，当绵羊BMSCs传至第6、7代时，就开始出现增殖减缓和细胞分化的现象，这极大地限制了其应用于临床治疗的研究进程。研究证明细胞在培养生长过程中出现的衰老、分化和凋亡和细胞端粒的缩短有关，TERT能激活端粒酶的活性，维持端粒长度。因此，我们尝试通过构建载体，将TERT转入绵羊BMSCs，培养、筛选和建立TERT-BMSCs稳转细胞系。并对构建的TERT-BMSCs稳转细胞系的细胞增殖能力、特征性表型、多向分化潜能和相关基因、蛋白表达等进行了初步研究，在转录组测序的基础上，进一步分析构建的 TERT-BMSCs 稳转细胞系PI3K/Akt信号通路在成骨分化过程中的调控机制是否发生变化，为干细胞移植治疗的研究提供理论参考。实验结果如下：
1. BMSCs的分离培养及鉴定
为了获得绵羊 BMSCs ，抽取绵羊髂骨骨髓，通过全骨髓贴壁法分离BMSCs，结果发现获得的细胞能呈现纺锤状或梭状贴壁生长，符合BMSCs的形态特征。采用流式细胞术分析BMSCs细胞表面标志物的表达情况，结果发现CD44 和CD90/THY1 阳性表达；而 CD34 和 CD45 阴性表达。实时荧光定量PCR分析BMSCs细胞表面标志物的表达情况，结果发现其能表达CD44、CD29和CD90/THY1；而不表达CD34和CD45，研究成功获得绵羊BMSCs。
2. TERT-BMSCs细胞系的建立及鉴定
为了获得永生化的绵羊 BMSCs ，通过构建 TERT 质粒表达载体，转入BMSCs ，经培养筛选获得 TERT-BMSCs 稳转细胞系。采用流式细胞术分析TERT-BMSCs稳转细胞系中的绿色荧光蛋白（GFP）的阳性表达率，结果显示在TERT-BMSCs稳转细胞中GFP阳性表达率为99.7%，而BMSCs为0.270%。采用实时荧光定量 PCR 和 western blot 分析 TERT-BMSCs 稳转细胞中 TERT在mRNA 和蛋白水平的表达，结果显示 TERT 在 mRNA 和蛋白水平的表达与BMSCs相比均显著上调。
获得转入TERT的绵羊BMSCs，采用流式细胞术分析TERT-BMSCs细胞表面标志物的表达情况，结果发现CD44和CD90/THY1阳性表达；而CD34和CD45阴性表达。实时荧光定量PCR分析TERT-BMSCs细胞表面标志物的表达情况，结果发现其能表达 CD44、CD29 和 CD90/THY1；而不表达 CD34 和CD45。以上结果表明，研究成功建立不仅能稳定表达TERT，还能保持原有细胞表型的TERT-BMSCs稳转细胞系。
3. TERT-BMSCs细胞系的生物学特性分析
为分析异位表达TERT对BMSCs生物学特性的影响，通过对 BMSCs和TERT-BMSCs 进行转录组测序分析，结果显示两组细胞均能高表达 CD44、CD29、CD90/THY1、CD105/ENG和 CD73 ，而 CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA class II呈现极低的表达或不表达，这与前面流式细胞术和实时荧光定量PCR的结果一致。
转录组测序结果发现差异性最显著的前三条信号通路分别是癌症转录通路、PI3K/Akt信号通路和细胞周期信号通路。进一步分析细胞周期信号通路相关基因表达结果发现 TERT-BMSCs 中的 CCNA2、CCNB1、CCND1、CCND2、CCNE1、CCNE2、CDK1、CDK6、RBL1、E2F1、E2F2、CDKN1A和CDKN2A表达水平与BMSCs相比显著升高， CCNA1、CCND3、CDK2和CDK4无显著差异，而 CDKN1B 表达水平显著下降，表明细胞周期信号通路在异位表达TERT后被激活了。分析癌症转录通路相关基因的表达结果显示在TERT-BMSCs中CDKN1A/p21、CDKN2A/p16和Klf4的表达水平与BMSCs相比呈现显著上调， NUPR1、p53、BMI-1、RXRA和GADD45的表达水平无显著差异，而c-myc、STAT-5、CDKN1B/p27、PPARγ、ARNT2、PDGF和PLAT的表达呈现显著下调，表明异位表达TERT后并没有显著上调特征性的致癌性相关基因。PI3K/Akt信号通路在第5章重点分析。
通过长达7个月的体外培养过程，结果发现TERT-BMSCs的增殖能力明显增强，细胞生命周期延长。通过对BMSCs和TERT-BMSCs进行成骨、成脂和成神经细胞的诱导分化，结果表明BMSCs在异位表达TERT后仍能保持多向分化的潜能。
4. PI3K/Akt信号通路调控TERT诱导的BMSCs成骨分化的机制研究
为探究PI3K/Akt信号通路对TERT诱导的BMSCs成骨分化的调控作用，对转录组测序结果中典型的成骨相关转录因子的表达情况进行分析，结果显示TERT-BMSCs中OPN、Sp7、OCN、Osteonectin和COL1A表达水平与BMSCs相比均显著上调，说明异位表达TERT可能具有促进BMSCs成骨分化的作用。
采用成骨诱导培养液对BMSCs和TERT-BMSCs进行成骨诱导分化，茜素红染色结果显示异位表达TERT显著增加钙化沉积；western blot结果显示异位表达TERT也能显著上调成骨特征性蛋白OPN、RUNX2的表达，说明异位表达TERT能增强BMSCs的成骨分化能力。
转录组测序分析PI3K/Akt信号通路相关基因的表达情况发现，异位表达TERT 能显著上调 FGF、VEGFC、NGF、EPHA2、IL6、IL6R、COL1A、LAMC2、ITGA6、Gβγ、PI3KR5、BCL2L1 和BCL2 ，这些基因对于PI3K/Akt信号通路均呈现不同程度的促进作用；而该通路的关键抑制基因PPP2R2/5和p27显著下调。Western blot分析PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达，结果显示在TERT-BMSCs中AKT和p-AKT的表达显著高于BMSCs，说明PI3K/Akt信号通路在异位表达TERT后被激活。在TERT-BMSCs加入PI3K抑制剂后，成骨分化能力和AKT、p-AKT、RUNX2和OPN的蛋白表达均显著下降，提示BMSCs异位表达TERT后，促进其成骨细胞诱导分化的内在机制可能是通过PI3K/Akt信号通路所介导。
综上所述，本研究建立的TERT-BMSCs细胞系，不仅能保持原有的特征性表型和多向分化潜能，其体外增殖能力和成骨分化能力也显著增强，且成骨分化增强作用可能是通过PI3K/Akt信号通路的激活所介导的。
1. BMSCs的分离培养及鉴定
为了获得绵羊 BMSCs ，抽取绵羊髂骨骨髓，通过全骨髓贴壁法分离BMSCs，结果发现获得的细胞能呈现纺锤状或梭状贴壁生长，符合BMSCs的形态特征。采用流式细胞术分析BMSCs细胞表面标志物的表达情况，结果发现CD44 和CD90/THY1 阳性表达；而 CD34 和 CD45 阴性表达。实时荧光定量PCR分析BMSCs细胞表面标志物的表达情况，结果发现其能表达CD44、CD29和CD90/THY1；而不表达CD34和CD45，研究成功获得绵羊BMSCs。
2. TERT-BMSCs细胞系的建立及鉴定
为了获得永生化的绵羊 BMSCs ，通过构建 TERT 质粒表达载体，转入BMSCs ，经培养筛选获得 TERT-BMSCs 稳转细胞系。采用流式细胞术分析TERT-BMSCs稳转细胞系中的绿色荧光蛋白（GFP）的阳性表达率，结果显示在TERT-BMSCs稳转细胞中GFP阳性表达率为99.7%，而BMSCs为0.270%。采用实时荧光定量 PCR 和 western blot 分析 TERT-BMSCs 稳转细胞中 TERT在mRNA 和蛋白水平的表达，结果显示 TERT 在 mRNA 和蛋白水平的表达与BMSCs相比均显著上调。
获得转入TERT的绵羊BMSCs，采用流式细胞术分析TERT-BMSCs细胞表面标志物的表达情况，结果发现CD44和CD90/THY1阳性表达；而CD34和CD45阴性表达。实时荧光定量PCR分析TERT-BMSCs细胞表面标志物的表达情况，结果发现其能表达 CD44、CD29 和 CD90/THY1；而不表达 CD34 和CD45。以上结果表明，研究成功建立不仅能稳定表达TERT，还能保持原有细胞表型的TERT-BMSCs稳转细胞系。
3. TERT-BMSCs细胞系的生物学特性分析
为分析异位表达TERT对BMSCs生物学特性的影响，通过对 BMSCs和TERT-BMSCs 进行转录组测序分析，结果显示两组细胞均能高表达 CD44、CD29、CD90/THY1、CD105/ENG和 CD73 ，而 CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA class II呈现极低的表达或不表达，这与前面流式细胞术和实时荧光定量PCR的结果一致。
转录组测序结果发现差异性最显著的前三条信号通路分别是癌症转录通路、PI3K/Akt信号通路和细胞周期信号通路。进一步分析细胞周期信号通路相关基因表达结果发现 TERT-BMSCs 中的 CCNA2、CCNB1、CCND1、CCND2、CCNE1、CCNE2、CDK1、CDK6、RBL1、E2F1、E2F2、CDKN1A和CDKN2A表达水平与BMSCs相比显著升高， CCNA1、CCND3、CDK2和CDK4无显著差异，而 CDKN1B 表达水平显著下降，表明细胞周期信号通路在异位表达TERT后被激活了。分析癌症转录通路相关基因的表达结果显示在TERT-BMSCs中CDKN1A/p21、CDKN2A/p16和Klf4的表达水平与BMSCs相比呈现显著上调， NUPR1、p53、BMI-1、RXRA和GADD45的表达水平无显著差异，而c-myc、STAT-5、CDKN1B/p27、PPARγ、ARNT2、PDGF和PLAT的表达呈现显著下调，表明异位表达TERT后并没有显著上调特征性的致癌性相关基因。PI3K/Akt信号通路在第5章重点分析。
通过长达7个月的体外培养过程，结果发现TERT-BMSCs的增殖能力明显增强，细胞生命周期延长。通过对BMSCs和TERT-BMSCs进行成骨、成脂和成神经细胞的诱导分化，结果表明BMSCs在异位表达TERT后仍能保持多向分化的潜能。
4. PI3K/Akt信号通路调控TERT诱导的BMSCs成骨分化的机制研究
为探究PI3K/Akt信号通路对TERT诱导的BMSCs成骨分化的调控作用，对转录组测序结果中典型的成骨相关转录因子的表达情况进行分析，结果显示TERT-BMSCs中OPN、Sp7、OCN、Osteonectin和COL1A表达水平与BMSCs相比均显著上调，说明异位表达TERT可能具有促进BMSCs成骨分化的作用。
采用成骨诱导培养液对BMSCs和TERT-BMSCs进行成骨诱导分化，茜素红染色结果显示异位表达TERT显著增加钙化沉积；western blot结果显示异位表达TERT也能显著上调成骨特征性蛋白OPN、RUNX2的表达，说明异位表达TERT能增强BMSCs的成骨分化能力。
转录组测序分析PI3K/Akt信号通路相关基因的表达情况发现，异位表达TERT 能显著上调 FGF、VEGFC、NGF、EPHA2、IL6、IL6R、COL1A、LAMC2、ITGA6、Gβγ、PI3KR5、BCL2L1 和BCL2 ，这些基因对于PI3K/Akt信号通路均呈现不同程度的促进作用；而该通路的关键抑制基因PPP2R2/5和p27显著下调。Western blot分析PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达，结果显示在TERT-BMSCs中AKT和p-AKT的表达显著高于BMSCs，说明PI3K/Akt信号通路在异位表达TERT后被激活。在TERT-BMSCs加入PI3K抑制剂后，成骨分化能力和AKT、p-AKT、RUNX2和OPN的蛋白表达均显著下降，提示BMSCs异位表达TERT后，促进其成骨细胞诱导分化的内在机制可能是通过PI3K/Akt信号通路所介导。
综上所述，本研究建立的TERT-BMSCs细胞系，不仅能保持原有的特征性表型和多向分化潜能，其体外增殖能力和成骨分化能力也显著增强，且成骨分化增强作用可能是通过PI3K/Akt信号通路的激活所介导的。