近年来,集约化高密度养殖模式的迅猛发展,低氮高能饲料的广泛利用,往往会引起鱼类脂肪代谢紊乱和生理异常,并可能导致鱼类脂肪肝病症,从而阻碍鱼类的生长发育、降低饲料利用效率和抗病能力,使得死亡率大大增加,给实际的养殖生产造成了巨大损失。因此,寻找预防或缓解脂肪代谢障碍的方法对水产养殖业的持续健康发展具有重大意义。已有研究表明胆碱可作为一种“抗脂肪肝”物质。本试验旨在探讨胆碱对投喂高脂饲料的团头鲂脂肪代谢、抗氧化能力、免疫机能等方面的影响,并对其作用机制做了初步探索。试验内容分为七部分:1胆碱对团头鲂生长、体组成和消化酶活性的影响本试验旨在探讨饲料中的脂肪和胆碱水平对团头鲂(均重:42.20±0.34 g)生长性能、体组成和消化机能的影响。本试验设2个脂肪水平(5 %和15 %)和2个胆碱水平(1200 mg/kg和2200 mg/kg),共配置4组等氮饲料。养殖试验在室内循环水系统中进行,8周后采样,对团头鲂的生长性能、全鱼和肌肉营养组成、肠道消化酶活性和脂蛋白酯酶活性进行测定。结果显示:饵料系数、脏体比、肝体比、全鱼和肌肉脂肪含量、肠道脂肪酶以及组织脂蛋白酯酶活性均随着饲料脂肪水平的上升而显著升高(P<0.05),但全鱼和肌肉水分含量、肠道淀粉酶活性却呈现相反的变化趋势。脏体比、腹脂率和全鱼脂肪水平均随着胆碱水平的上升而显著降低(P<0.05)。饲料中的脂肪和胆碱水平对团头鲂增重率有交互作用,并在15 %脂肪和2200 mg/kg胆碱组显著高于其他各组(P<0.05)。本试验表明在高脂饲料中增加胆碱添加能够改善鱼体生长性能、提高肠道消化酶活性,并减少鱼体脂肪积累。2胆碱对团头鲂生理状态与肝胜组织结构的影响试验方案同1。本试验旨在探讨饲料中脂肪和胆碱水平对团头鲂健康状态,即生理生化、免疫机能和肝脏组织结构的影响。结果显示:饲料中过高的脂肪水平显著增加了肝脏的脂肪堆积(P<0.05),提高血浆谷草和谷丙转氨酶活性(P<0.05),并降低了白细胞数、溶菌酶活性、总蛋白和球蛋白水平(P<0.05)。肝脏组织结构的观察到15 %脂肪和1200 mg/kg胆碱组肝细胞中存在大量脂滴,并伴随着细胞核变性、核膜残缺、线粒体水肿、内质网排列杂乱等细胞超微结构的异常。此结果表明高脂会引起团头鲂肝脏组织结构损伤和机体免疫降低。然而,在高脂饲料中增加胆碱添加,显著降低(P<0.05)了肝脏脂肪含量、血浆转氨酶活性,并显著(P<0.05)提高白细胞数和球蛋白水平,同时肝脏形态及超微结构也趋于正常。但在5 %脂肪组添加不同水平的胆碱,各指标并无显著差异(P>0.05)。本实验表明,胆碱在机体内发挥重要的生理作用,即维持肝脏结构和功能,增强机体免疫机能,保持鱼体的健康状态。3胆碱对团头鲂肝脏脂肪沉积和转运的调控本试验旨在探讨饲料中的脂肪和胆碱水平对团头鲂幼鱼(均重:9.80±0.35 g)肝脏脂肪沉积和转运的影响和调控。本试验设3个脂肪水平(5 %、8 %和11 %)和2个胆碱水平(1200 mg/kg和1800 mg/kg),共配置6组等氮饲料。养殖试验在室内循环水系统中进行8周。结果显示:脏体比、肝体比、血浆谷草转氨酶、甘油三酯和胆固醇水平、肝脏脂肪含量均随着饲料脂肪水平的上升而显著升高(P<0.05),但肝脏S-腺苷甲硫氨酸(SAM)水平与之呈现相反的变化趋势。饵料系数、血浆胆固醇水平、肝脏脂肪含量均随着胆碱水平的上升而显著降低(P<0.05),然而肝脏SAM和还原型谷胱甘肽水平,以及肝脏微粒体甘油三酯转运蛋白(MTTP)和载脂蛋白B-100(ApoB-100)基因表达水平随着胆碱添加量的增加而显著升高(P<0.05)。油红O染色对各组的肝细胞脂肪积累程度有了更加直观的说明。饲料中的脂肪和胆碱水平对团头鲂增重率有交互作用,并在11 %和1800 mg/kg胆碱组显著高于其他各组(P<0.05)。本试验说明胆碱可以增加SAM的生成,并通过上调MTTP和ApoB-100基因的表达丰度,增强极低密度脂蛋白的合成和分泌,继而促进了肝脏脂肪的转运,减少了脂肪沉积。4团头鲂MTTP基因cDNA克隆、表达特征分析以及与PPARs基因表达的关系试验方案同3。本试验采用RACE技术,对团头鲂微粒体甘油三酯转运蛋白(MTTP)基因cDNA全序列进行克隆,测定了 MTTP在各组织的表达差异,并研究了胆碱对投喂高脂饲料的团头鲂肝脏、肌肉和肠道MTTP与过氧化物酶体增殖受物激活受体α与β(PPARα、β)基因表达的影响,同时分析了 MTTP与PPARα、β在脂肪代谢中的关系。团头鲂MTTP基因序列全长3457 bp,含有2661 bp的开放阅读框,编码了 886个氨基酸,并含有一个24 bp的信号肽序列。预测其蛋白分子量为97482.5 Da,等电点为7.95。在MTTP组织差异表达分析中得到:肝脏和肠道组织表达量最高,表明MTTP主要参与机体脂肪转运过程。肌肉、肾脏组织次之,脾脏、眼、鳃组织中表达量最低。MTTP在肝脏、肠道和肌肉组织的表达量随着饲料中脂肪水平的上升而升高。在11 %脂肪和1200 mg/kg胆碱组,肝脏和肌肉MTTP基因表达水平显著降低(P<0.05),但在高脂饲料中增加胆碱添加,其表达水平又显著上升(P<0.05)。PPARα、β基因在各组的表达量与此呈现相似的变化趋势。由上述结果表明MTTP与PPARα、β在脂肪代谢中具有协同作用,同时说明胆碱可能具有促进脂肪氧化分解的作用,从而减少了脂肪在肝脏的沉积。5.胆碱对团头鲂体内胰岛素及下调信号转导的调控本试验旨在探讨饲料中的脂肪和胆碱水平对团头鲂幼鱼(均重:56.8±0.50 g)体内胰岛素信号转导的影响以及与脂肪代谢的关系。本试验设2个脂肪水平(5 %和11 %)和2个胆碱水平(1200 mg/kg和1800 mg/kg),共配置4组等氮饲料。结果显示:血浆胰岛素水平、肝脏胰岛素受体和胰岛素受体底物基因表达量、磷脂醜肌醇-3激酶和蛋白激酶B活性均随着饲料脂肪水平的上升而显著降低(P<0.05)。但提高饲料中的胆碱水平,血液葡萄糖和胰岛素水平、肝脏脂肪含量显著降低(P<0.05),并且胰岛素信号通路中间介质的活性有所恢复,同时也上调了肝脏乙酰辅酶A羧化酶、脂肪合成酶和肉碱酯酰转移Ⅰ基因表达丰度。本试验表明适量增加饲料中胆碱的添加,能够缓解因高脂而引起的胰岛素信号转导障碍,从而改善机体的代谢状态。6胆碱对团头鲂肝脏线粒体功能、氧化应激及细胞凋亡的影响试验方案同5。本试验旨在探讨饲料中的脂肪和胆碱水平对团头鲂肝脏线粒体功能、氧化应激以及肝细胞凋亡的影响。结果显示:线粒体钠钾ATP酶、琥珀酸脱氢酶、呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ活性以及复合物Ⅰ的基因表达量随着饲料脂肪水平的上升而显著降低(P<0.05),表明过多的脂肪摄入会导致线粒体的功能障碍。提高饲料中的胆碱水平,线粒体酶活性、呼吸链复合物及基因表达水平均显著升高(P<0.05),肝脏活性氧和丙二醛含量则呈现相反的变化趋势。TUNEL原位检测观察到在高脂饲料中增加胆碱添加,细胞凋亡数量显著减少。本试验表明适量增加胆碱添加,能够在一定程度维持肝脏线粒体功能、增强对氧化应激的抵御能力。7胆碱对团头鲂CPT Ⅰ启动子甲基化的影响与调控试验方案同5。本试验旨在探讨饲料中的脂肪和胆碱水平对团头鲂肉碱酯醜转移酶Ⅰ(CPTⅠ)基因启动子甲基化状态的影响以及与其基因表达之间的关系。本试验克隆获得了 MTTP、ApoB-100和CPT Ⅰ的DNA启动子序列,并预测发现MTTP和ApoB-100基因启动子区域没有CpG位点,但在CPT Ⅰ基因启动子区存在一个CpG岛,长度为150 bp,位于5’上游的-725至-576位点,该CpG岛包含14个CpG位点。通过甲基化实验,得到各试验组CPT Ⅰ基因启动子甲基化的程度和位点差异。结果显示:随着饲料脂肪的增加,CPT Ⅰ基因启动子甲基化水平显著(P<0.01)降低,但随着饲料胆碱水平的上升而显著(P<0.01)升高。并且饲料脂肪和胆碱水平对CPT Ⅰ启动子甲基化水平具有交互作用,在5 %脂肪和1800 mg/kg胆碱组中,其甲基化程度最高,而在11 %脂肪和1200 mg/kg胆碱组最低。在不同的脂肪和胆碱水平下,CPT Ⅰ甲基化的位点存在很大的差异性。5 %脂肪和1200 mg/kg胆碱组在第3、4、9、10四个CpG位点的甲基化程度均显著高于1800mg/kg胆碱组,但在第6、8、13、14这四个CpG位点,只有添加1800 mg/kg胆碱时处于被甲基化状态。11 %脂肪和1200 mg/kg胆碱组,只有第5个CpG位点被甲基化。而在11 %脂肪水平添加1800 mg/kg胆碱时,在第2、3、11三个CpG位点的甲基化程度显著高于其他各组。CPTI基因表达量与其启动子甲基化程度呈相似的变化趋势。本试验表明CPT Ⅰ启动子的DNA甲基化对其基因表达具有调控作用,并且甲基化的程度与位点差异,都可能成为其调控作用的发生机制,继而影响机体的脂肪代谢。