骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSC)是组织工程的首选种子细胞,其在临床治疗领域也展现了广阔的应用前景。而近几年的研究发现,啮齿类动物甚至是人的MSC在体外长期培养过程中,部分细胞在经历复制性衰老后会重新获得增殖能力并永生化。这一现象称为MSC体外自发转化。转化的MSC不仅表现出某些与肿瘤细胞相似的特征,且移植到裸鼠体内可形成实质性肿瘤。MSC自发性转化的频率极高(45.8%),本质上不同于一般细胞在体外培养时因基因突变而发生的“永生化”；同时,恢复增殖的细胞逐渐出现于经过漫长生长停滞后的衰老MSC中,因而亦很难用MSC群体中本身存在少数不衰老的细胞来解释。因此,MSC自发性转化很可能是在体外培养条件下,基因的表观遗传学修饰发生改变,导致部分细胞获得逃逸衰老的能力。MSC是如何逃脱衰老的?众所周知,p16INK4a是细胞衰老机制中的重要调控因子之一。p16INK4a高表达导致细胞进入衰老并维持其衰老状态。而在大多数永生化的细胞以及自发性转化后的MSC,p16INK4a的表达是消失的。究竟是什么原因导致MSC在自发转化的过程中出现p16INK4a基因沉默?本课题从表观遗传学的角度对这一问题进行了探讨：第一部分：大鼠MSC的体外自发转化及不同转化阶段的确定目的：胚胎发育和干细胞分化研究证实,基因表达的表观遗传学调控通常发生在细胞命运发生重大变化的节点上。本试验的目的是建立MSC自发转化的模型、确定转化过程的关键节点(阶段)并获取纯化的不同阶段MSC,为下一步的表观遗传学机制研究打基础。方法：取全骨髓细胞贴壁分离、培养,获取大鼠MSC,流式细胞术鉴定表面标志分子,体外诱导鉴定成骨和成脂肪能力。相差显微镜观察记录连续传代培养MSC的自发转化过程。通过计算细胞倍增指数(PD)、BrdU掺入率；衰老相关SA-β-gal染色率等量化指标,确定MSC自发转化的关键阶段。结果：1、新鲜分离的细胞培养并传代至第2代时,细胞呈集落样贴壁生长、显示典型的成纤维细胞形态。MSC表面标志CD29和CD90的阳性率分别为97.5%±1.5和87.4%±2.5；而造血系统细胞标志CD34、CD45的阳性率仅0.7%±0.3和0.5%±0.2。这些细胞经诱导后可向脂肪细胞和成骨细胞分化。以上特征符合公认的骨髓MSC鉴定“金标准”2、第2代的MSC增殖活跃、BrdU掺入率>75%,SA-β-gal染色阳性率<1%,定义为衰老前MSC。第6代(24～25PD)MSC停止增殖,BrdU掺入率<1%, SA-β-gal染色阳性率>95%,定义为衰老期MSC。衰老MSC在经历约4周生长停滞后,可见少数重新开始增殖,在第5周时形成小的集落。此时按3：1富集传代获得的纯化重新增殖的细胞失去了衰老细胞的特点,BrdU掺入率>75%,SA-β-gal染色阳性率<1%,故定义为衰老逃逸MSC。在随后的4个月的传代培养至第35代的细胞显示更强的增殖能力,BrdU掺入率>90%,SA-β-gal染色阳性率<0.1%,定义为转化后MSC。转化后MSC具有与衰老前MSC相同的表面标志。结论：1.大鼠MSC的自发转化过程可以分为四个阶段：衰老前期、衰老期、衰老逃逸期和转化后期。2.不同于人类MSC,大鼠MSC在衰老逃逸后不再出现危机期,这很可能是大鼠MSC更容易发生自发转化的重要原因第二部分：MSC自发转化过程中p16INK4a的表达与p16INK4a基因组蛋白修饰及DNA甲基化的关系目的：分析MSC自发转化不同阶段p16INK4a的表达与p16INK4a基因启动区及相关区域H3K9me-pan (H3K9me)、H3K27me-3(H3K27me)修饰和DNA甲基化水平的改变。方法：根据第一部分实验的标准获取衰老前、衰老、衰老逃逸、和转化后MSC;RT-qPCR及Westernblot检测各个阶段细胞P16INK4amRNA和蛋白的表达；染色质免疫共沉淀技术(ChIP)检测p16INK4a基因启动区及相关区域H3K27me及H3K9me的变化；重硫酸盐修饰后测序(BSP)的方法检测p16INK4a基因启动区DNA甲基化水平的改变。结果：与衰老前期MSC比较,在衰老期MSCp16INK4a表达的升高,p16INK4a基因的H3K27me修饰水平明显降低,DNA甲基化水平也由衰老前的30-35%降低到14-24%。无论是衰老前期还是在衰老期MSC, p16INK4a基因启动区及相关区均未检测出H3K9me。在衰老逃逸期及转化后期MSC, p16INK4a的表达消失。虽然H3K27me的修饰仅恢复到略高于衰老前水平,但p16INK4a基因DNA的甲基化水平明显上升(在衰老逃逸期的MSC中升高到70-80%、在转化后期MSC达85-97%)。这期间p16INK4a基因DNA的甲基化水平的上升伴随着H3K9me修饰的出现和升高。结论：MSC体外自发转化过程中,p16INK4a表达的变化与p16INK4a基因组蛋白修饰类型及DNA甲基化水平密切相关。当MSC从衰老前期进入衰老期时,p16INK4a表达的升高伴随着p16INK4a基因H3K27me和DNA甲基化水平的降低。从MSC逃逸衰老至完成转化,p16INK4a表达的消失伴随着p16INK4a基因DNA的高度甲基化；此阶段虽然H3K27me仅恢复到略高于衰老前水平,但H3K9me在p16INK4a基因上出现并随DNA甲基化的上升而升高,衰老逃逸期及转化后MSC中,除H3K27me外,p16INK4a基因由DNA高度甲基化所致的沉默还与该基因出现H3K9me修饰相关。第三部分：Ezh2对MSC p16INK4a基因组蛋白修饰及DNA甲基化的作用目的：检测组蛋白甲基转移酶Ezh2在MSC自发转化过程中的变化并分析其对p16INK4a基因组蛋白修饰及DNA甲基化的作用。方法：采用RT-qPCR及Western blot分析Ezh2在MSC自发转化四个关键阶段的表达变化；采用染色质免疫共沉淀技术分析Ezh2与p16INK4a基因的结合水平；并应用RNA干扰技术抑制Ezh2的表达,分析Ezh2对p16INK4a基因组蛋白修饰、DNA甲基化水平及细胞衰老的影响。结果：当MSC从衰老前期进入衰老期时,Ezh2表达水平明显降低,且从p16INK4a基因上解离。在衰老逃逸及转化后的MSC, Ezh2的表达升高至衰老前细胞表达水平的两倍以上。Ezh2在p16INK4a基因上重新出现并恢复至衰老前水平。RNA干扰试验显示,在衰老前,衰老逃逸及转化后MSC,虽然抑制Ezh2均可降低p16INK4a基因上的H3K27me,但预期的DNA甲基化水平下降仅见于衰老前MSC。且干扰Ezh2的表达对衰老逃逸及转化后MSC中p16INK4a基因上的H3K9me、DNA高甲基化及该基因的沉默状态无影响。SA-β-gal染色显示：干扰Ezh2的表达可加速衰老前MSC的早衰老,但这一效应不出现于衰老逃逸及转化后MSC。结论：在正常MSC(从衰老前期到衰老期)p16INK4a基因的表达变化在表观遗传学水平受Ezh2介导的H3K27me及DNA甲基化调控。但在衰老逃逸及转化后的MSC,由DNA高度甲基化出现引起的p16INK4a基因沉默并不依赖于Ezh2介导的H3K27me修饰机制,而很可能与该基因出现H3K9me修饰有关。后者可能是导致MSC逃逸复制衰老并发生自发转化的重要表观遗传学机制之一。