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中药是中医治病的物质基础,其质量安全问题不容忽视。中药从生产、采收、加工、运输、贮藏等过程均有可能因各种因素而受真菌侵染,真菌产生的次级代谢产物真菌毒素具有致癌、致畸、肾毒性等有害作用,严重威胁着人类的健康。由于中药材品种多,来源复杂,使用范围广,受产毒真菌污染情况复杂,准确评价难度大,需要全面的调查和分析。因此,建立快速准确的中药材污染产毒真菌鉴定方法是解决这个难题的关键。1目的针对黄曲霉毒素（AFs）产生菌、杂色曲霉毒素（ST）产生菌、赭曲霉毒素A（OTA）产生菌,建立一种同时检测这3类产毒真菌的快速、高效、灵敏的多重PCR方法,并应用于中药材、食品等表面污染真菌的检测,分析该方法用于产毒真菌预警、控制方面的价值。2方法2.1多重PCR同时检测中药材中污染的3类产毒真菌方法的建立以产毒真菌为模板,考察不同的真菌DNA提取方法、PCR引物、PCR扩增条件等对PCR产物特异性、明亮度的影响,筛选出最优的组合,建立多重PCR检测方法;接着,考察药材基质对多重PCR检测灵敏度的影响。以人参为代表药材,优化药材表面产毒真菌的DNA提取方法,提高检测灵敏度;同时,以人工感染产毒真菌的人参（阳性药材）来模拟市场上污染的药材,考察方法的准确性。进一步,针对巴戟天、佛手、岗梅、苦杏仁、三七、山药、石斛、熟地、桃仁共9种药材及花生、玉米、小麦、芝麻共4种食品,制备人工感染产毒真菌的样品,考察各药材、食品基质对多重PCR方法的影响,以评价该多重PCR方法的适用性。最后,用建立的多重PCR方法检测市售的人参等药材、花生等食品样品。2.2 LC-MS/MS检测6种真菌毒素针对收集的市售人参等药材、花生等食品样品,应用LC-MS/MS法检测3种类型产毒真菌所产生的6种真菌毒素（黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2,赭曲霉毒素A和杂色曲霉毒素）,验证多重PCR检测结果的可靠性。3结果通过比较2对真菌通用引物,11对真菌毒素（AFs、ST、OTA）生物合成相关的特异性引物,确定了由4对引物组成的最佳组合,它们分别是AF-1,AFST-1 OTA-1和Wen2。当4对引物的摩尔比为AF-1:AFST-1:OTA-1:wen2=2:1:2:2时,建立的多重PCR方法结果准确性、特异性较好。多重PCR检测纯菌株的检出限为103 spores/mL。以人参药材为代表,采用试剂盒或者CTAB法提取药材表面产毒真菌的DNA提取较为合适,可以克服药材基质对多重PCR的影响。多重PCR同时检测含有人参药材基质的三种产毒菌的灵敏度达103 spores/mL。与多重PCR检测纯菌株的灵敏度结果比较,发现该方法灵敏度受人参药材基质影响较少。同时,多重PCR法检测人工感染人参药材,检出限为103105 spores/mL,结果均无干扰杂带,该方法准确性高。分别含有佛手等9种药材基质的多重PCR检测灵敏度在103104 spores/mL之间,与纯菌株的多重PCR检测灵敏度结果大体一致,表明所建立的多重PCR检测灵敏度受药材基质影响不明显。基于人工感染药材进行的多重PCR试验结果显示,除熟地外,其它9种感染药材103105 spores/mL之间。表明了该方法可用于多种药材的检测,结果准确性高。对随机购自广州地区的5间医院和5间药店的10种中药材共95份样品的进行多重PCR检测结果显示,78.9%中药材受真菌的污染,在三种产毒菌中,产杂色曲霉毒素菌污染中药材情况最为严重,其中ST产生菌污染率为18.9%,AFs产生菌污染率为8.4%,OTA产生菌污染率为9.5%。使用LC-MS/MS对上述相应的95份药材进行检测,结果显示,相应样品被检测出的毒素与对应的产毒菌一致,表明多重PCR检测方法的可靠性。进一步,考察了花生、玉米、小麦和芝麻等4种类型样品基质对上述多重PCR检测灵敏度的影响,结果均在102103 spores/ml之间,与基于纯菌株测得的灵敏度接近,表明该方法也适用于这四种食品的检测。对收集与广州地区6家连锁超市共22份样品进行多重PCR检测。其中普遍受真菌（50%）的污染,三种产毒菌检测中,ST产生菌（13.6%）污染最为严重,其次AFs产生菌（4.5%）,未检测到OTA产生菌。4结论本研究应用4重PCR技术,建立了一种不经分离纯化,直接检测中药材和食品表面污染AFs、ST、OTA产生菌的简便、快速、稳定的方法。该方法无需对样品表面污染真菌进行传统的培养和纯化,即可直接检测多种中药材和食品样品表面污染产毒真菌,可以显著提高检测效率。将本方法应用于10种中药材和4种食品的检测,结果显示受真菌污染较普遍,在检测的三种类型产毒菌中,产杂色曲霉菌污染最为严重,与前期文献报道一致,需引起关注。