论文部分内容阅读
微孢子虫是一类专性胞内寄生的机会性病原,能感染几乎所有的无脊椎动物和脊椎动物,包括人类,被美国CDC列为B类优先病原。海伦脑炎微孢子虫（Encephalitozoon hellem）是感染人的主要微孢子虫之一,是人类健康的潜在威胁,但其侵染致病的机理尚不清楚。分泌蛋白是病原的重要毒力因子,在侵染致病过程中发挥着重要作用。本课题组前期对海伦脑炎微孢子虫的分泌蛋白进行了分析,在其中筛选到了一个被分泌定位至宿主细胞核的蛋白EH7108。结构域预测分析发现,EH7108具有信号肽（SP）和核定位信号（NLS）,但没有已知功能的结构域。系统发生分析发现,该蛋白广泛存在于微孢子虫中,可能具有重要的作用。因此,本研究对EH7108的表达定位特征,在病原侵染增殖过程中的作用及对宿主细胞的调控作用进行了分析,主要研究结果如下:1.EH7108在宿主细胞中的表达定位特征通过RT-qPCR分析发现,EH7108编码基因在感染后36 h至72 h持续高水平转录,推测EH7108可能在微孢子虫增殖过程中发挥着重要的作用。为明确EH7108在感染细胞中的定位特征,我们分别构建了EH7108::HA::eGFP、EH7108ΔSP::HA::eGFP和EH7108ΔNLS::HA::eGFP真核表达载体,在HEK293细胞中过表达融合蛋白,利用间接免疫荧光实验（Indirect Immunofluorescence Assay,IFA）检测发现EH7108定位于HEK293细胞核内,而缺失了NLS基序的蛋白则不能定位于细胞核内。同时,提取过表达EH7108的细胞核蛋白,利用免疫印迹（western blot）检测,结果也显示EH7108定位于宿主的细胞核内。此外,利用制备的EH7108的多克隆抗体对感染的细胞进行IFA分析发现,EH7108定位于E.hellem的裂殖体内以及HFF细胞的核内。这些实验结果表明,EH7108是分泌蛋白,且能够靶向定位至宿主细胞核中发挥调控作用。2.EH7108对病原增殖的作用EH7108在感染细胞中的转录及定位特征,暗示着该蛋白可能对微孢子虫的增殖具有重要的作用。因此,我们对转EH7108基因的宿主细胞进行感染实验,并采用绝对定量PCR和荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization,FISH）进行分析。定量结果显示,与对照组相比,在细胞感染后2 d,微孢子虫的拷贝数显著提高。同时FISH分析发现,寄生泡（parasitophorous vacuole,PV）在转EH7108基因的细胞中出现的时间比对照组早,在感染36 h后,实验组中的成熟孢子明显比对照组多。这些实验结果表明,EH7108促进了病原的增殖和寄生泡的形成。3.EH7108对宿主细胞的调控作用在HEK293细胞中分别过表达HA::eGFP和EH7108::HA::eGFP,利用RNA-seq对转基因细胞进行分析发现,有34个基因的表达发生了显著变化,其中22个基因上调表达,12个基因下调表达。对差异表达基因进行KEGG富集分析发现,内质网相关的蛋白降解（ER-associated degradation,ERAD）和甲状腺激素合成信号通路（Thyriod hormone synthesis）发生了变化,其中内质网相关蛋白降解通路富集的基因比例较高,而甲状腺激素信号通路富集的2个差异基因在内质网相关的蛋白降解通路也被富集到。另外,Gene Ontology聚类分析发现,有4个生物学过程发生变化,其中3个生物学过程与内质网功能相关,包括内质网应激的应答（Response to endoplasmic reticulum stress）和内质网相关的泛素化蛋白催化过程（ER-associated ubiquitin-dependent protein catabolic process）。RNA-seq分析表明,EH7108具有调控宿主细胞ERAD通路的作用,即E.hellem可能利用EH7108调控宿主内质网中某些蛋白的降解。进一步,利用RT-qPCR对特定的基因进行分析发现,转基因细胞中ERAD通路相关基因PDIA4、HSPA5、HERPUDI的表达显著上调,与RNA-seq分析的结果一致,进一步表明EH7108具有调控宿主内质网中错误折叠蛋白降解的作用。利用Western blot分析同样发现,转基因细胞中PDIA4的蛋白含量显著上调,且蛋白的泛素化水平也被上调。利用RNAi敲降PDIA4的表达发现,HERPUDI的表达显著下调,表明PDIA4是ERAD通路中的一个重要的调控基因。以上结果表明,EH7108进入宿主细胞核直接或间接地上调了PDIA4的表达,影响了ERAD通路,从而调控了某些蛋白的降解,导致相关通路的功能发生变化。综上所述,EH7108是E.hellem的分泌蛋白,能够靶向宿主细胞核,可能具有调控宿主细胞内质网中糖蛋白降解的作用,是病原的一种重要的毒力因子。该研究对揭示微孢子虫的侵染致病机理具有重要价值。